绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2（keratin-associated protein 2,KAP2）基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463 bp的KAP2基因,开放阅读框架（ORF）长414 bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸（Arg）变为谷氨酰胺（Gln）,属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84 ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

不同羊毛纤维直径细毛羊皮肤组织差异表达蛋白质研究

试验旨在研究不同纤维直径的细毛羊皮肤组织中毛囊差异表达的蛋白质,探讨与羊毛细度相关的蛋白质功能。应用双向凝胶电泳技术建立细毛羊皮肤组织中毛囊差异表达蛋白质图谱;运用ImageMaster 2D Platinum软件检测细毛羊毛囊组织差异表达蛋白质;通过质谱鉴定技术和数据库比对等方法开展细毛羊皮肤组织毛囊特异性蛋白质分类和功能鉴定。结果成功鉴定出94个差异蛋白质,其中,相同年龄超细型细毛羊和细型细毛羊皮肤毛囊组织中有73个差异蛋白质;不同年龄的超细型细毛羊毛囊组织中有21个差异蛋白质。按功能属性划分得到了角蛋白、分子伴侣类蛋白、细胞骨架结构类蛋白、14-3-3蛋白、蛋白酶类、肌球蛋白、血清白蛋白和其他蛋白8类功能蛋白。结果提示,应用生物信息学技术分析这些差异蛋白与羊毛纤维直径的内在联系,为优质细毛羊的培育提供直接有效的基因资源信息,对提高羊毛品质具有重要的意义。     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574bp,其中ORF区192bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3′UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸-酪氨酸蛋白(HGTP)启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著(P0.01),HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关(P0.01),与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关(P0.05),而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关(P0.01)。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著(P0.01)。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性(P0.01)。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

绵羊KAP8-1基因克隆与表达分析

本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。     

一周岁内滩羊皮肤差异表达蛋白研究

为研究一周岁内滩羊皮肤中的差异表达蛋白,本试验利用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离了滩羊不同生长阶段皮肤蛋白,经考马斯亮蓝染色,用PDQuest 8.0软件检测并分析差异蛋白点,并经MALDITOF/TOF-MS/MS鉴定。对4个生长时期的蛋白图谱进行两两比对,共发现了19个差异蛋白点,质谱成功鉴定出15个蛋白点共13种蛋白,可能与滩羊皮肤生长调控有关的蛋白有14-3-3蛋白σ亚型（14-3-3 protein sigma）、膜联蛋白A2（annexin A2）、角蛋白25（keratin 25）、微管蛋白α链（tubulin alpha chain）。对差异表达蛋白进行分析,发现这些差异表达蛋白可能与滩羊皮肤不同生长阶段的毛囊周期性变化有关。一周岁内滩羊皮肤差异蛋白的发现为滩羊皮肤的年变化规律研究奠定理论基础。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1基因差异表达研究

试验旨在研究不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1（keratin associated protein 8-1,KAP8-1）基因相对表达量,从而明确KAP8-1基因对绵羊皮肤毛囊发育的调控作用。采用Real-time PCR SYBR GreenⅠ染料法,测定KAP8-1基因荧光定量Ct值,所得结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。结果表明,南非肉用美利奴羊（♂）×东北细毛羊（♀）组、南非肉用美利奴羊（♂）×小尾寒羊（♀）组、杜泊羊（♂）×小尾寒羊（♀）组3个品种羊皮肤毛囊内KAP8-1基因均有表达,且三者相对表达量的比值为7.56∶2.19∶1。说明KAP8-1基因对皮肤毛囊发育、羊毛品质差异均具有一定的调控作用,且品种之间存在一定的差异。     

鄂尔多斯细毛羊KAP15-1和KAP27-1基因多态性及其与羊毛性状的关联分析

本研究旨在鉴定细毛羊主要经济性状相关的分子标记,以462只1岁鄂尔多斯细毛羊母羊为实验动物,联合DNA混池测序和Snapshot技术,检测KAP15-1基因和KAP27-1基因多态性。采用SAS 9.2对非同义突变位点和鄂尔多斯细毛羊羊毛性状进行相关性分析,利用DNASTAR软件预测蛋白质二级结构。结果显示：KAP15-1基因的SNP1突变位点对羊毛纤维直径标准差和纤维直径变异系数有显著影响;SNP1突变位点对蛋白质二级结构的影响集中在60～80号氨基酸之间。KAP27-1基因的SNP3突变位点对羊毛平均纤维直径有显著影响,对纤维直径标准差和剪毛前体重影响极显著;SNP3突变导致的蛋白质二级结构变化分布在整个氨基酸序列上,但是集中在Beta、Turn、Coil Regions和Antigenic Index部分。综上,KAP15-1基因的SNP1突变和KAP27-1基因的SNP3突变影响鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径,在实际育种中可作为该性状的潜在分子标记。     

Study on Differentially Expressed Proteins of Tan Sheep Skin Using iTRAQ Technology

In order to study the differential protein associated with the thickness and curvature of the flax fiber and the specific spike composition of Tan sheep, this study used the isotope labeling relative and absolute quantification (iTRAQ) proteomics methods,and combined with multidimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) identification and screening of skin protein from Tan sheep,Inner Mongolia Sunitou sheep,Zhongwei goat and Xinji Fine-wool sheep,and the Proteome Discoverer 1.4 software was used for quantitative analysis, combined with database search, identification of differential protein. Finally, the differential proteins was analyzed by the GO and Pathway analysis methods. 1 161 proteins were identified from the four kinds of sheep skin,30 different proteins were found between Inner Mongolia Sunitou sheep and Tan sheep,112 differential proteins were found between Zhongwei goats and Tan sheep,107 differential proteins were found between Xinji Fine-wool sheep and Tan sheep,the skin differential proteins were analyzed for each group,it was found that the 14-3-3 protein sigma, KRT25, KRT34, KRT85, TCHH, KAP6 and KAP11.1 might be related to the thickness and curvature of the flax fiber and the formation of specific spike shape of Tan sheep. The result would provide a scientific basis for the breeding of Tan sheep fur quality.     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574 bp,其中ORF区192 bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3'UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。     

Proteome Array on Differentially Expressed Proteins of Skin Tissue in Fine-wool Sheep with Different Fiber Diameter

The purpose of this paper was to study the differentially expressed proteins of hair follicles in skin tissue with different fiber diameter of Fine-wool sheep, and discussed the function of proteins related to wool fineness.The differentially expressed protein maps of Fine-wool sheep skin hair follicle were established by two-dimensional gel electrophoresis, and the differentially expressed protein spots were detected and analyzed by the ImageMaster 2D Platinum software, Fine-wool sheep skin hair follicle specific proteins were classified and functional identified by mass spectrum identification technology and database matching method.The results showed that 94 different proteins were successfully identified in Fine-wool sheep with different fiber diameter, including 73 different proteins between superfine wool sheep and Fine-wool sheep at the same age, and 21 different proteins of superfine wool sheep at the different age.According to the functional properties got eight kind of functional proteins, keratin, molecular chaperone protein, cytoskeleton protein, 14-3-3 protein, protease, myosin, serum albumin, other protein, respectively.These results indicated that the internal relation between the differentially expressed protein and the wool fiber diameter was analyzed by the bioinformatics knowledge, which would provide effective genetic resources information directly for high quality breeding of Fine-wool sheep, and had important practical significance for improving the quality of the wool.     

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、东北细毛羊、杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）、生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度（He）、纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60 bp 3个碱基（CTT）缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊的χ²值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著（P>0.05）;GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型：DD,该突变为GDF9基因外显子2上477 bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ²值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。     

Study on Skin Differential Expression Proteins of Tan Sheep Within One Year Old

In order to study different expressed proteins of one-year-old Tan sheep skin, two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) was used to separate the Tan sheep skin proteins of different growth stages by Coomassie blue staining, with PDQuest 8.0 software to detect and analyze differences in protein spots,and were identified by MALDITOF/TOF-MS/MS.Protein maps of four growth stages were performed between pairwise, after testing found a total of 19 differentially expressed proteins, mass spectrometry successfully identified 15 protein spots and a total of 13 proteins, of which 14-3-3 σ protein isoforms, annexin A2, keratin 25 and tubulin α chain might be related to growth regulation sheep skin. Those different expressed proteins might be associated with different stages of growth of Tan sheep skin follicles cyclical changes. The different proteins of one-year-old Tan sheep skin provided theoretical basis for annual variation of Tan sheep skin.