Study on Expression of Toxoplasma gondii Rhoptry Neck Protein 5 Gene in Different Developmental Stages

To investigate the relationship between the expression level of Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5 (TgRON5) gene in different developmental stages and the virulence of Toxoplasma gondii, the objective of this study was to examine the different expression of TgRON5 gene in different developmental stages of type Ⅱ Toxoplasma gondii PRU strain. Specific primers were designed according to the sequence of TgRON5 gene, and ACT1 gene of Toxoplasma gondii was used as a reference gene. Following the establishment of standard curve for the target and reference genes, in order to confirm the consistency of their amplification efficiency, Real-time PCR method was applied to determine and compare the expression level of TgRON5 gene in development stage which including tachyzoite, bradyzoite, non-sporulated oocyst and sporulated oocyst. The results demonstrated that TgRON5 was expressed in all developmental stages but the sporulated oocysts had the highest expression, followed by the non-sporulated oocysts, the third was tachyzoite, and the lowest was bradyzoite. It suggests that the synthesis and secretion of TgRON5 protein was closely associated with the invasiveness of the parasite. All these findings had important implications for elucidating the functions of TgRON5 involved in the invasion of Toxoplasma gondii.     

弓形虫棒状蛋白ROP54编码基因的生物信息学分析及原核表达

为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白,本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列,并连接至pMD-18-T载体,构建出克隆质粒pMD-ROP54后,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接,构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示,成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示,测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽,亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经,SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达,且能够被犬抗弓形虫血清识别,具有良好的反应原性。本研究成功...     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2 (EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异.本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF;以E.tenella 子...     

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2（rh—potryprotein2）的部分基因，构建pGEX—KG—ROP2重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转入E．coli BL21CodonPlus中，在IPTG诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE和Western—blot分析鉴定。结果表明，扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9％，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000，可被兔抗弓形虫免疫血清识别。     

CAPN3基因在草原红牛不同组织中的表达差异

钙激活中性蛋白酶(CAPN3)参与哺乳动物体内多种重要的生理生化过程,但是有关它的确切生理功能和作用机制研究较少.本研究采用实时荧光定量PCR技术检测CAPN3基因在草原红牛多种组织中的表达水平差异情况.试验结果表明,CAPN3基因在所检测草原红牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、瘤胃和背最长肌8种组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平有所不同.草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织,十二指肠和瘤胃中的CAPN3基因表达量显著高于心脏、肝脏、肺脏、肾脏和背最长肌.本试验为肉牛肉质性状的改良提供了分子遗传学依据,并为深入研究草原红牛体内CAPN3基因的生物学作用及作用机制奠定了基础.     

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

刚地弓形虫Rop18基因的原核表达及鉴定

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定.然后阳性重组质粒转化入E.coli BL21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定.结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列（AJ132530）的同源性达99.6 %,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别.说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础.     

弓形虫Real-time PCR检测方法的建立和初步应用

根据已发表的弓形虫529 bp高拷贝序列,设计特异性引物和探针,建立TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测方法。将该方法用于360份临床样本的检测,并与常规PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术进行对比分析。结果表明:Real-time PCR检测的阳性率(11.11%)高于LAMP(7.5%)和常规PCR(3.61%)。采用本实验室建立的Real-time PCR,对收集于不同地区4种动物的750份临床样本检测发现,不同种类动物血液样本中均可检测到弓形虫感染,其中羊的感染率最高(17.8%),猪次之(4.22%),牛较低(1.98%),犬最低(1.37%)。     

弓形虫GT1虫株GRA15蛋白的表达及其反应原性分析

为了分析弓形虫GT1虫株GRA15(GRA15_GT1)蛋白的反应原性,通过PCR扩增编码GRA15_GT152～635氨基酸肽段的基因片段,构建pGEX-6P-1-GRA15_GT1载体,转化BL21菌诱导表达;通过SDS-PAGE和Western blot方法进行表达验证及反应原性分析。结果显示:SDS-PAGE及以GST标签抗体为一抗进行Western blot,均有目的条带,比理论值稍大;以猪弓形虫阳性血清为一抗的Western blot条带与GST抗体孵育后的条带大小一致。上述结果表明,GRA15_GT1蛋白具有较好的反应原性,这为下一步分段表达GRA15_GT1蛋白,研究其在弓形虫血清学分型中的应用奠定了基础。     

弓形虫蛋白质翻译后修饰研究进展

弓形虫是一种复杂的单细胞原生动物寄生虫,通过入侵宿主细胞、分裂和诱导宿主细胞破裂等一系列的过程,在温血动物体内进行增殖。弓形虫的生物学特征受基因组、表观遗传及转录等多种因素的调控。蛋白质翻译后修饰（protein post-translational modifications,PTMs）,如磷酸化、泛素化、巴豆酰化、棕榈酰化、琥珀酰化、乙酰化、甲基化、糖基化和二羟基异丁酰化等,是弓形虫调节对细胞外刺激的反应和生命周期转变的主要机制之一。弓形虫蛋白质翻译后修饰通过改变靶蛋白的定位、结构、活性、蛋白质-蛋白质相互作用等增加蛋白质的复杂性和多样性,从而在虫体生命周期的任何时间点都可以发挥至关重要的作用。在这篇综述中,作者重点对弓形虫蛋白质翻译后修饰进行简要总结,以期为深入研究弓形虫的生物学特征奠定基础。     

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染小鼠基因表达谱的影响

探讨桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠基因表达谱的影响,并对其抗虫机理进行分析。BABL/C小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子103个,建立小鼠弓形虫感染模型。将小鼠随机分成3组:空白对照组、感染对照组、桦褐孔菌多糖治疗组。采集动物肝脏迅速冻存,提取总RNA,检测RNA质量,扩增RNA,进行芯片杂交,扫描后进行数据分析。结果:经SOM分析筛选出桦褐孔菌多糖治疗组的有效差异基因,并对其进行功能注释,分析其治疗弓形虫的主要原因。结果表明:桦褐孔菌多糖可有效治疗弓形虫感染引起的病理损伤,其抗弓形虫机理是通过调节宿主细胞因子水平,促进Th1/Th2平衡,控制Toll样受体信号通路以及对机体整体调控达到抗弓形虫目的。     

刚地弓形虫微线体蛋白3的研究进展

微线体蛋白3(MIC3)是刚地弓形虫生活史各个时期均能表达的分泌蛋白,具有较强的免疫反应性,在弓形虫对宿主细胞的识别、黏附及入侵过程中发挥重要作用。深入研究弓形虫MIC3有助于研制弓形虫病诊断制剂及疫苗以防制弓形虫病。文章综述了近年来关于MIC3的分子生物学特征、相关疫苗及其用于弓形虫病诊断方面的研究进展。