空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法的建立

为建立血清中空肠弯曲菌抗体的荧光偏振检测(FPIA)方法,本研究对空肠弯曲菌的黏附蛋白PEB1A进行原核表达。Western blot鉴定显示该重组蛋白具有良好的抗原性;FITC标记空肠弯曲菌黏附蛋白PEB1A形成示踪物,通过确定示踪物的最佳反应浓度、反应时间及血清最佳稀释度,建立空肠弯曲菌的FPIA抗体检测方法。结果显示:本实验建立的空肠弯曲菌FPIA抗体检测方法的检测标准为FP值≥150m P为阳性,FP值150为阴性。该方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与产肠毒素型大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌的抗血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法对抗体的最低检测效价为1∶80,批内和批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性。表明本研究建立的FPIA方法为血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测提供了一种可行的方法。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。     

以原核表达的猪δ冠状病毒N蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中猪δ冠状病毒(PDCoV)抗体的间接ELISA方法,本研究根据PDCoV的N基因序列设计特异性引物,扩增出N蛋白全基因序列,将其克隆至低温表达载体p Cold I中并转入BL21,诱导表达获得大小约为41 ku的可溶性目的蛋白;western blot试验表明所表达的蛋白具有反应活性。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了PDCoV间接ELISA抗体检测方法。结果表明,本研究建立的ELISA方法阴阳性临界值为0.316,与猪流行性腹泻病毒等6种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性和稳定性均较好。应用建立的间接ELISA方法,对收集自江西各地区282份猪血清进行检测,阳性率为12.8%(36/282),表明PDCoV在我省猪群中普遍存在。本实验建立的PDCoV抗体捕获间接ELISA为临床上猪群PDCoV感染监测和流行病学调查提供了实验依据。     

IBRV重组gD蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

通过优化牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gD基因序列为Sf9细胞偏好密码子,转座形成穿梭载体,将质粒瞬时转染Sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化重组IBRV gD蛋白;以制备的重组IBRV gD蛋白为包被抗原,建立检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法,并通过比对检测已知血清中和抗体效价的牛血清,验证所建立的间接ELISA方法的敏感性、特异性与重复性等指标。结果显示：本研究建立的间接ELISA方法对相关的牛病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:512,组内和组间变异系数均低于10%;使用建立的间接ELISA检测方法结合血清中和试验,对480份临床血清样品进行检测,发现两者敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。结果表明,本研究建立的检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪伪狂犬病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的PRVSA株基因组序列,PCR扩增了长约1070bp的gD基因片段,将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组gD蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,建立了检测猪伪狂犬病毒抗体的PPA—ELISA检测方法。该方法与其他7种常见猪病病毒（CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV－2、PEDV、TGEV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5％,批间重复性试验的变异系数小于10％;与IDEXXgD-ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92．0％、95．1％和88．1％。本研究建立的PRVgD-PPA—ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的免疫猪群抗体监测、快速诊断和PRV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.     

新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。     

Prokaryotic Expression of PEB1A Protein of Campylobacter jejuni and Establishment of an Indirect ELISA

In order to develop an indirect ELISA method to detect Campylobacter jejuni antibody, PEB1A gene of Campylobacter jejuni was cloned and amplified by PCR, the prokaryotic expression vector pET32a-PEBIA was constructed, and then transferred into the expression strain E.coli BL21 (DE3), and obtained about 47 ku of soluble protein. Western blotting result showed that the expressed recombinant protein had good biological activity, an indirect ELISA method for detecting antibody against Campylobacter jejuni was developed using expressed PEB1A protein as coating antigen,and detected its specificity, sensitivity, repeatability, respectively. The results showed that the established method for detection of Campylobacter jejuni antibody critical value was 0.3424. This method only specifically reacts with Campylobacter jejuni positive sera, and had no cross-reactivity with other antiserum and strong specificity. In addition, the coefficients of variations in both inter-and intra-assay were less than 5% indicating that it had good repeatability and stability. The establishment of this method could be applied to the rapid detection of Campylobacter jejuni in serum, and provided basis for further prevention and control of Campylobacter jejuni diarrhea.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

为研制特异性敏感性较好的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测和诊断,将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到p ET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达形式为可溶性表达,通过Western blot证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的N蛋白经过超声、离心、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原检测血清中的PRRSV抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了能检测PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法;对方法的特异性和重复性以及与同类成品试剂盒间的应用效果对比进行了试验。结果表明,研究建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中PRRSV抗体、监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪δ冠状病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白（M）作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rM-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-M,经诱导表达后获得了重组M蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rM-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV M蛋白,建立了PDCoV-rM-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。     

丝状支原体山羊亚种LPPA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

[目的] 建立基于丝状支原体山羊亚种（Mmc）膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。[方法] 扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。[结果] 通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0 μg/100 μL,血清稀释度为1：300,3% BSA封闭1 h为最佳反应条件,临界值为2.738。本试验建立的间接ELISA方法批内和批间变异系数均<10%,证明该方法具有良好的重复性;对绵羊肺炎支原体（Mo）、蓝舌病病毒（BTV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、羊口蹄疫病毒（FMDV）、弓形虫及山羊痘病毒（GPV）标准阳性血清的检测均为阴性,表明该方法特异性较强;184份临床血清临床应用结果显示,该方法与正向间接血凝诊断试剂盒检测结果阳性符合率为93.33%,阴性符合率为75.23%,两者相对符合率为82.61%。[结论] 本研究成功建立了Mmc LPPA蛋白间接ELISA抗体检测方法,为临床Mmc血清抗体水平的监测及Mmc血清流行病学调查奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。     

布鲁菌bp26基因的表达与bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒,将布鲁菌bp26基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,以纯化后的重组蛋白bp26包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,重组蛋白分子质量约为41 ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有良好的免疫原性;优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为3.6 μg/mL,血清样本的阳性临界值为0.370;特异性试验结果表明,重组蛋白与牛结核菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等多种病原体的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果表明,血清稀释至1:12800时,仍检测为阳性;该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%;用该试剂盒检测241份临床牛血清样本,并与试管凝集试验(SAT)检测结果比较,两者符合率为97.1%。原核表达的布鲁菌bp26具有良好的免疫原性,研制的布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,可为布鲁菌基因缺失标记疫苗的应用提供配套的血清学诊断方法。     

非洲猪瘟病毒无标签p30-ELISA抗体检测方法的建立及应用

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、热性、出血性、高度接触性传染病,临床症状以败血症、皮炎和关节炎为特征,高发病率和高死亡率。为建立临床检测ASFV抗体的间接ELISA检测方法,本研究扩增了ASFV-CP204L基因,通过pET-30a原核表达系统表达p30蛋白,使用Ni-NTA纯化表达产物,通过肠激酶切除外源性蛋白,得到无His-组氨酸标签的p30蛋白,以此为诊断抗原,建立间接ELISA方法。结果显示：表达的无标签p30重组蛋白大小约为30 ku,与ASF阳性猪血清具有较好的反应原性;确定ELISA抗原包被浓度为1 μg·mL^-1,根据ROC曲线下面积确定S/P值>0.398判定为阳性,批内、批间变异系数均<10%;与PCV2、CSFV、PRV-gE、PRRSV阳性血清无交叉反应与INGENASA商品化试剂盒总符合率为97.78%。用该方法分别检测标准阳性血清、动物感染试验血清和收集的区域性临床血清644份,该方法最低可检测到1∶512倍稀释的标准阳性血清样品;检测感染动物血清,其中80%(4/5)的试验动物在第10天抗体为阳性。644份临床猪血清样品中抗体阳性率为7.61%,其中,母猪、后备母猪、仔猪、保育猪和育肥猪抗体阳性率分别为3.03%、0%、4.94%、7.55%和28.7%。本试验建立的ASFV-p30间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可应用于ASFV的抗体检测,为ASF的诊断和流行病学调查提供了技术手段。     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。