空肠弯曲菌肠毒素间接ELISA检测法的建立

通过对ＣＥ３３种检测方法的比较研究,证实间接ＥＬＩＳＡ是检测ＣＥ最为敏感,简便,快速的方法,在２４ｈ内即可得到结果。ＣＨＯ法也较敏感,但要求较高。大鼠肠袢试验虽然操作繁杂,却是传统的肠毒素检测法,结果更具说服力。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫原性分析

根据空肠弯曲菌基因序列设计引物,以菌株ATCC 29428为模板扩增出peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中,并对克隆片段测序,比较所测序列与不同来源弯曲菌的同源性;用软件改造并合成peb1A基因78 bp～780 bp区间片段,PCR扩增后,构建出表达载体pET-28a(+)-peb 1Ag,转化至E.c...     

Prokaryotic Expression of PEB1A Protein of Campylobacter jejuni and Establishment of an Indirect ELISA

In order to develop an indirect ELISA method to detect Campylobacter jejuni antibody, PEB1A gene of Campylobacter jejuni was cloned and amplified by PCR, the prokaryotic expression vector pET32a-PEBIA was constructed, and then transferred into the expression strain E.coli BL21 (DE3), and obtained about 47 ku of soluble protein. Western blotting result showed that the expressed recombinant protein had good biological activity, an indirect ELISA method for detecting antibody against Campylobacter jejuni was developed using expressed PEB1A protein as coating antigen,and detected its specificity, sensitivity, repeatability, respectively. The results showed that the established method for detection of Campylobacter jejuni antibody critical value was 0.3424. This method only specifically reacts with Campylobacter jejuni positive sera, and had no cross-reactivity with other antiserum and strong specificity. In addition, the coefficients of variations in both inter-and intra-assay were less than 5% indicating that it had good repeatability and stability. The establishment of this method could be applied to the rapid detection of Campylobacter jejuni in serum, and provided basis for further prevention and control of Campylobacter jejuni diarrhea.     

间接ELISA对鸡猪空肠弯曲菌快速检验的实验研究

以方阵滴定法确定了空肠弯曲菌抗血清、酶结合物的最佳工作浓度和孵育时间,从而立了快速检测空肠弯曲菌的间接ELISA。该试验可检出含8～10个空肠弯曲菌经24h培养的标本(含30万个菌/ml的肉汤培养物);不与沙门氏菌等15种对照菌及其混合液发生交叉反应。以鸡源和猪源空肠弯曲菌抗血清分别作为ELISA的第一抗体,对144份鸡泄殖腔粪便标本和116份猪直肠粪便标本的选择性增菌肉汤培养物进行了检测。其阳性率分别为83.3％和79.3％,可于28h内报告结果;常规法对上述标本的阳性检出率分别为85.4％和81％,但程序繁琐,需5～7d方能获得最终检查结果。两种方法对鸡、猪粪便标本检测结果的阳性符合率,分别为97.5％与97.9％。     

水溶性量子点标记空肠弯曲菌黏附蛋白的制备

为建立荧光免疫分析方法对空肠弯曲菌的快速检测,利用基因工程技术构建pET32a-peb1A原核表达载体,并对重组蛋白进行了抗原性分析。利用共价偶联的方法,在水溶性缩合剂EDC和催化剂DMAP的作用下,使水溶性量子点的羧基与重组蛋白的羟基结合,发生酯化反应,并通过磷酸盐缓冲溶液进行透析纯化得到目标偶联物。采用荧光分光光度法对偶联物进行表征,并利用荧光偏振免疫分析方法对空肠弯曲菌阳性血清进行检测。结果表明:空肠弯曲菌黏附蛋白PEB1A具有良好的抗原性,且量子点标记空肠弯曲菌黏附蛋白前后的荧光光谱发射峰由595 nm偏移至592 nm。示踪物与阳性血清混合前后荧光偏振值变化△80mP。由此证明,空肠弯曲菌黏附蛋白成功偶联到水溶性量子点上,且结构未受到破坏。通过荧光偏振法实现了对空肠弯曲菌的检测,所制备的示踪物具有良好的特异性,为建立荧光疫分析方法对空肠弯曲菌的快速检测提供依据。     

BVDV E2蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本试验克隆、表达了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的E2蛋白,以表达纯化后的E2蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了间接ELISA检测法.确定该方法的阴阳判定临界值为0.33,抗原包被浓度为8μg/mL,一抗的最佳稀释度为1:100,10％PEG4000为最佳封闭液,酶标二抗最佳稀释度为1:6000.用建立的ELISA...     

鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。     

犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。     

鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。     

Prokaryotic Expression of Thymidine Kinase Gene of Duck Plague Virus and Establishment of an Indirect ELISA Based on the Protein

In the study,an indirect ELISA was developed using the purified thymidine kinase (TK) protein as antigens to detect the antibody of duck plague virus (DPV).The TK gene of DPV was amplified by PCR using specific primers designed according to the sequence of TK gene in GenBank.Using gene recombination technology,the TK gene was cloned and inserted into prokaryotic expression vector pET-32a and the recombinant plasmid was identified by PCR,double enzyme digestion and sequence analysis.The positive recombinant plasmid was then transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by IPTG.The expressed protein was purified by gel extraction and analyzed by Western blotting.Then an indirect ELISA was established to detect DPV antibody by using the purified recombinant TK as the coating antigen.The other assay conditions were also optimized.The recombinant plasmid was constructed successfully and Western blotting detected the target protein,TK recombinant protein could be recognized by positive serum,and the result indicated that the recombinant protein had good antigenicity.The optimum reaction conditions were as follow:The optimal dilution of enzyme labelled antibody was 1:200,the optimal dilutions of antigen and antibody were 1:400 and 1:200,reaction time was 60 min,most prefer blocking solution was 5% BSA,closed for 60 min,chromogenic time was 10 min.The method had good stability and high sensitivity,and it could provide a reliable method for the clinical detection,immunization surveillance,and prevention and cure of DP.     

狂犬病毒G蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

目前狂犬病疫苗的效力检验采用NIH法,需要使用狂犬病毒CVS-24毒株进行攻毒试验,具有一定的生物安全风险。为寻求替代NIH法中脑内攻毒试验的方法,研究扩增狂犬病毒G蛋白基因,并将其克隆至大肠杆菌pET-32a载体上进行表达,以该蛋白作包被抗原,摸索试验条件,建立了检测小鼠血清抗体效价的间接ELISA方法。使用此方法与国际公认的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法比较,两者检测结果曲线相关系数为0.986,表明相关性较好,但ELSIA方法更加快捷、简便。本试验建立的间接ELISA方法可用于检测小鼠血清中狂犬病抗体,为狂犬病毒血清抗体测定和单克隆抗体筛选提供依据。     

绵羊肺炎支原体P6058aa-928aa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58－928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_58aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_58aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。     

丝状支原体山羊亚种LPPA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。【方法】扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。【结果】通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度为1∶300,3%BSA封闭...     

Prokaryotic Expression and Development of an Indirect ELISA Detection Method of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus N Protein

In the study,the recombinant expression plasmid pET28a-TGEV-N was constructed,and expression and purification of the TGEV N protein was completed.Through SDS-PAGE and Western blotting analysis,the N protein could be identified by transmissible gastroenteritis virus (TGEV) positive serum.Using the TGEV N protein as diagnosis antigen,we established an indirect ELISA method for detecting TGEV serum antibodies.The coefficients of variation of intro-batch and inter-batch duplicability test were less than 5%.The specificity was 100%,and the rate of false positive and the false negative rate were 0 and 5%,respectively.No cross reactions with seven porcine diseases positive serum were detected.Using this method,the clinical serum samples were detected.The results showed 100% coincidence rate compared with neutralization test.The method could detect TGEV antibody quickly and effectively,and had good repeatability and specificity,which laid the foundation for the development of standardized diagnostic kits.     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D_{450 nm}值≥ 0.30为阳性,样品D_{450 nm}值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。