赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

为获得赤羽病病毒（Akabane virus, AKAV）核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a（＋）进行连接,转化感受态细胞BL21（DE3）.将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定.结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%.工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTM Purification System（含Ni2＋）天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白.     

不同传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2表达差异性分析

将在不同时间、地域从传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中获得的15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖，经氯仿处理后，采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不边疆蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒，检测表明，病毒主要分布于40%蔗糖层，对纯化病毒进行SDS-PAGE分析，结果显示，病毒结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB-DV主要保护性抗原VP2高表达疫苗的研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白研究进展

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起禽类的传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD),主要侵害免疫器官,直接引起感染鸡的发病或死亡,更重要的是能引起鸡的免疫抑制,导致对其他病原因子的易感性增强及对疫苗的免疫应答能力下降。近年来随着反向遗传等新技术的应用,对该病毒的基因组及编码蛋白研究有了长足的进步,本文对该病毒主要结构蛋白方面的研究进展进行了综述。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。     

传染性法氏囊病的研究进展

本文综述了传染性法氏囊病病毒（IBDV）的分子结构与功能的关系。IBDV的抗原变异主要与病毒VP2蛋白的2个亲水区有关；分子流行病学调查结果显示，不同地区分离到超毒株与欧洲的超强毒株间有相似的来源，超强毒株赖以产生的分子基础尚不明确，且新的超强毒株不断出现。表达VP2基因的重组疫苗有一定的保护作用。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表达及其免疫原性研究

VP2蛋白是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白及保护性抗原,为了研究原核表达的IBDV VP2可溶性蛋白的免疫原性,从IBDV超强毒SD株克隆出VP2基因,将其克隆于pET-30a原核表达质粒,并转化至大肠杆菌菌株BL21中,诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot分析,发现在37 kDa处出现特异性蛋白条带,与预期结果一致,且大部分VP2蛋白存在于菌液上清液中。经诱导条件的优化,菌液上清液表达的VP2蛋白琼脂扩散(AGP)效价可达1∶16。用不同AGP效价的VP2蛋白乳化配苗,免疫SPF鸡,免疫后21 d,进行AGP抗体效价测定及攻毒保护试验,发现VP2蛋白以AGP效价不低于1∶8配苗,免疫鸡用超强毒SD株及经典株BC6/85株攻毒,保护率均为10/10。结果表明,成功获得了表达VP2可溶性蛋白的基因工程表达菌BL21-VP2,且表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离与VP2基因序列分析

为了探讨传染性法氏囊病流行的原因,从4个发生传染性法氏囊病的鸡场采集病变法氏囊,处理后用特异性单克隆抗体进行荧光检测,结果均为阳性;然后提取病毒RNA,利用RT-PCR扩增病毒VP2基因cDNA并进行序列和遗传进化分析.结果表明:所分离的4株病毒均具有超强毒的分子特征,属于传染性法氏囊病病毒超强毒病毒群,4株病毒在第1亲水区的212位有1个氨基酸突变(D→N);HLJ-3和HLJ-4在第2亲水区321位还有1个突变(A→V),这些突变可能造成传染性法氏囊病病毒的抗原发生变异,进而发生免疫失败.     

传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

为探索一个已免疫传染性法氏囊病活疫苗的817肉鸡场在免疫后发生IBD的原因,本研究对病料进行病毒分离,通过RT-PCR扩增分离株VP2基因后进行相关分析,并对分离株的致病性进行测定。结果显示,分离到一株传染性法氏囊病病毒,将其命名为ZHA001株;ZHA001株 VP2 基因序列与参考株的同源性为 90.1%～97.9%,与超强毒株氨基酸序列同源性大于99%;具有超强毒株的特征性氨基酸位点;遗传进化分析发现,ZHA001株属于超强毒株分支;致病性试验中,发病率为100%,致死率为90%。结果表明：IBDV ZHA001株为超强毒病毒。     

不同传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP_2表达差异性分析

将在不同时间、地域从传染性法氏囊病 (IBD)发病鸡群中获得的 15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖 ,经氯仿处理后 ,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒 ,检测表明 ,病毒主要分布于 40 %蔗糖层。对纯化病毒进行SDS_PAGE分析 ,结果显示 ,病毒结构蛋白VP2 在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB DV主要保护性抗原VP2 高表达疫苗的研究奠定了基础     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

Soluble Expression,Purification and Activity Analysis of Capsid Protein of Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus

To obtain the capsid VP2 with high quality, VP2 gene of very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) Gx was cloned and inserted into pCold-Ⅰ and the prokaryotic expression plasmid pCold-Ⅰ-GxVP2 was constructed. In engineering bacteria Transetta(DE3), the induction conditions of protein VP2 expression were optimized.With affinity chromatography and gel filtration, protein VP2 was purified. With the monoclonal antibody directed Western blotting, protein VP2 was identified. Using SPF chicken, immunocompetence of VP2 was evaluated. The results showed that the dissoluble protein VP2 was expressed successfully in Transetta(DE3) in cold-shock conditions; Protein VP2 was purified and the concentration was 542 μg/mL; The purified protein VP2 not only reacted with the monoclonal antibody against protein VP2, but also induced specific immune response in immunized chickens. In general, with 15℃ of cold-shock condition, 120 r/min of shaking culture, 1 mmol/L of IPTG,inducting for 24 h, soluble capsid VP2 of IBDV with immunocompetence was successfully expressed and purified.The preparation of highly purified, soluble capsid protein with functional activity laid the foundation for further researches on the pathogenic mechanism.     

鸡传染性法氏囊病超强毒LX株的分离鉴定

从一免疫失败鸡场中分离到１株鸡传染性法氏囊病野毒株,命名为ＬＸ株。经血清学、鸡胚接种、病毒形态、外源病毒（ＣＡＡ、ＮＤＶ和ＩＢＶ）排除试验等证实该分离物为纯净的ＩＢＤＶ。人工感染试验表明,该ＬＸ株接种８龄ＳＰＦ鸡后第２天鸡只精神 沉郁,拉白色或绿色粪便,发病率为１００％,第３￣４天出现死亡高峰,而后很少引起死亡,死亡率达９２．３％,剖检可见全身性出血素质,法氏囊呈“紫葡萄样”外观,脾脏肿大,胸腺萎     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus C4 Strain

This study was aimed to investigate the relationship between the virulence characteristics of infectious bursal disease virus(IBDV) C4 strain and its VP2 amino acid sequence. The RNA of IBDV C4 strain was extracted,and its VP2 gene was amplified by RT-PCR.VP2 nucleotide sequences and deduced amino acids of different virulent IBDV strains were compared. At the same time, prokaryotic expression vector pET-32a(+) was used to express the VP2 gene. The expression of recombinant VP2 protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that the VP2 gene of IBDV C4 strain belonged to the very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) in evolutionary relationship, the VP2 nucleotides homology between IBDV C4 strain and other vvIBDV strains were 98.1% to 98.7%, and there were no mutations in S-W-S-A-S-G-S (326-332 amino acids) and 222(A), 256(I), 294(I) and 299(S). The VP2 amino acid sequence of IBDV C4 strain was consistent with the characteristics of other vvIBDV strains. However, there were three differences amino acids sites at 201(D/G), 281(G/R) and 313(V/A) between the amino acids of the C4 strain and the very virulent strain UK661. And the change of 281(R) was in the small hydrophilic region of 279 to 290, which was related to the antigenicity of the virus; The recombinant VP2 protein molecular weight expressed in Escherichia coli BL21 was about 67 ku. This study provided a basis for further research on antigenic changes resulting from amino acid variation of 201(G), 281 (R) and 313(A). These results indicated that the VP2 gene of the IBDV C4 strain was consistent with the major characteristics of the vvIBDV strain VP2 gene. The difference of three amino acid sites in the vvIBDV strain C4 might be related to the evolution of virulence of IBDV strain in China.     

传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus in Egypt: Epidemiology,Isolation and Immunogenicity of Classic Vaccine

Infectious bursal disease (IBD) is still a significant threat facing the Egyptian poultry industry. In this study, eight very virulent IBD viruses (vvIBDV), originating from acute IBD outbreaks recorded in lower and upper Egypt, were studied with respect to their ability to replicate in cell culture, antigenicity and immunogenicity of classic vaccine. Six continuous cell lines and one primary cell culture were tested for replication of the vvIBDVs. None of the vvIBDV isolates could be adapted to BGM-70, Vero, BHK, RK-13 or MDBK cell lines or chicken embryo fibroblast cells after six blind passages. Serological typing with three neutralizing monoclonal antibodies showed antigenic variation among vvIBDVs. The immunogenicity induced by graded doses of classic-intermediate vaccine in both IBD-resistant (Mandarah) and susceptible (Gimmizah) Egyptian chickens was investigated. The protection of the tested doses was evaluated by measurement of the serological response and resistance to vvIBDV challenge 10 days post vaccination. Similar antibody responses to the vaccine were generated over a wide (100-fold) dose range. It was concluded that single vaccination, by eye drops, with classic-intermediate vaccine (1 x) could protect chickens against clinical disease and mortality. However, the immune responses generated by 1 x, 10 x or 100 x vaccine doses did not protect against bursal damage following challenge. This finding points to the highly invasive nature of the prevailing vvIBDVs in Egypt.     

一种获得重组传染性法氏囊病病毒的新方法

采用 RT- PCR技术 ,从传染性法氏囊病病毒 (IBDV)细胞适应株 GZ911中扩增了 A片段的 2个片段 GA5和 GA3,从中国分离的 IBDV超强毒株 L X中扩增了 B片段的 2个片段 L B5和 L B3。将 GA5和 GA3克隆到质粒p Bss K的 Eco R / Kpn 位点 ,将 L B5和 L B3克隆到 p Bss K的 Eco R / Xba 位点 ,获得携带 GZ911完整 A片段基因的质粒 GA- p Bss K和携带 L X完整 B片段基因的质粒 L B- p Bss K。然后将 GZ911的 A片段 c DNA和 L X的 B片段c DNA分别插入带有巨细胞病毒立即早期加强子 /启动子的质粒 p AL TER- MAX中 ,获得重组质粒 GA- p AL TER和L B- p AL TER。用 GA- p AL TER和 L B- p AL TER共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,获得具有感染活性的重组 IBDV,命名为 r IBDV- GZ L X。该方法的建立为在体外对 IBDV的基因组进行遗传操作 ,进而彻底了解 IBDV基因的结构与功能的关系打下了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒rVP2蛋白高效组装亚病毒颗粒的鉴定

为获得高纯度的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白自组装的亚病毒颗粒（subviral particles,SVPs）,并对重组VP2蛋白（rVP2）SVPs的组装效率和均一性进行评价,本试验利用大肠杆菌表达IBDV rVP2,通过SDS-PAGE和Western blotting对蛋白表达情况和免疫反应性进行鉴定,通过阴离子交换层析和切向流超滤浓缩系统纯化rVP2蛋白,并通过透射电镜（TEM）、高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）、蔗糖密度梯度离心及粒径和表面电位（Zeta potential）等多种检测技术对单个SVP组装形态和整体组装情况进行分析检测,初步建立了IBDV rVP2 SVPs组装效率的系统性检测方法。结果显示,在大肠杆菌中实现IBDV rVP2的大部分可溶性表达,且能与鸡IBDV阳性血清有明显的免疫反应性,纯化后rVP2纯度提高66.9倍,回收率达到93.3%。TEM观察rVP2自组装成直径约25 nm的SVPs,视野内SVPs大小均一,均匀分散。HPSEC检测结果显示,rVP2 SVPs的分子质量约为2 482 ku,与20个VP2三聚体形成的T=1二十面体SVPs分子质量一致。蔗糖密度梯度离心检测结果显示,rVP2 SVPs体积分布均一,组装效率高。粒径和Zeta电位检测结果表明,rVP2 SVPs颗粒分散度较好、体系稳定,有利于rVP2 SVPs的长期保存。本试验通过多种检测技术对rVP2 SVPs的组装情况进行检测分析,实现了rVP2 SVPs的高效组装,为IBDV SVPs疫苗的质量控制提供了有力支撑。     

传染性法氏囊病病毒变异株的致病性

传染性法氏囊病病毒变异ＧＣ９０２株可引起１０日龄ＳＰＦ鸡胚肝脏坏死和脾脏明显肿大及较高的死亡率。接种２周龄ＳＰＦ雏鸡,同时设标准Ｉ型强毒ＣＪ８０１株和标准变异株强毒１０８４Ａ株接种对照,该毒株接种后第３天才出现法氏囊粘膜浆膜出血、个别黄化、质硬等病变,且于第４天法氏囊明显萎缩变小,至接种后２０天法氏囊仍严重萎缩;接种后第２天引起脾脏显著肿大,于第１２天时大小恢复正常。试验结果表明,该ＧＣ９０２株对ＳＰＦ雏鸡的致病性与标准变异株基本一致,仅有一定的差异,但明显不同于标准Ｉ型强毒株的致病性。     

用DIG－标记核酸探针鉴定传染性法氏囊病病毒

用ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针进行斑点杂交试验鉴定传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。实验结果证明，该探针能与试验的１０株ＩＢＤＶ的ＲＮＡ发生限性杂交反应，结果清晰稳定，无非特异性反应。本试验是一种新的敏感的ＩＢＤＶ鉴定方法。     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。