GsCRCK 基因转化农菁１号苜蓿及其耐盐性分析

 GsCRCK 基因是参与胁迫早期应答的钙／钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK  正向调控拟 南芥对ＮａＣｌ和ＡＢＡ 胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因犌狊犆犚犆犓转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现 实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁１号苜蓿,获得大量抗性植株。经ＰＣＲ 和ＲＴ－ＰＣＲ 检测证明 GsCRCK  基因已整合到农菁１号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的２ 个转基因株系进行耐盐 性分析,在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下进行胁迫处理,测定处理０,３,６,９,１２,１５ｄ后的质膜透性、丙二醛（ＭＤＡ）和叶 绿素（Ｃｈｌ）含量,以及胁迫１５ｄ时的ＳＯＤ 活性;并统计４００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理１５ｄ时各株系的死亡率。结果显 示,３００ｍｍｏｌ／Ｌ 高盐胁迫１５ｄ后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电 导率极显著低于野生型,ＭＤＡ 含量也显著低于野生型,而Ｃｈｌ含量和ＳＯＤ 活性都显著高于野生型;在４００ ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下,２个转基因株系的死亡率分别为１３．３３％和１０．００％,明显低于野生型植株（６３．３３％）。表明 GsCRCK 基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

两种紫花苜蓿苗期耐盐生理特性的初步研究及其耐盐性比较

为研究2种紫花苜蓿:肇东苜蓿和农菁1号苜蓿的耐盐程度及其在盐胁迫处理下的生理反应规律,在1/2 Hogland营养液水培条件下,用0,50,100,200,300,400 mmol/L NaCl溶液模拟盐胁迫处理2种紫花苜蓿幼苗,观察记录各处理的盐害情况,分别测定胁迫前和胁迫3,6,9,12,15,21 d的丙二醛(MDA)、叶绿素(Chl)和脯氨酸(Pro)含量,分析了不同胁迫程度和胁迫时间下相关生理指标的变化情况,并采用隶属函数法对二者的耐盐性进行了综合评价。结果表明,低浓度盐胁迫对其生长无显著影响,2种苜蓿具有较强的耐盐性,能够抵抗一段时间较高浓度(200 mmol/L)的盐胁迫。随着浓度的增加,MDA含量逐渐升高,但随胁迫时间的延长,在200,300 mmol/L处理下,2种苜蓿的MDA含量表现出先增加,后下降,然后又上升的动态变化趋势。随着胁迫浓度的增加和时间的延长,二者受到的盐害逐渐增大,Chl含量逐渐降低,Pro含量大量累积,但二者的Pro累积程度与它们的耐盐表现并不完全一致。综合评价结果表明,在100,200 mmol/L NaCl胁迫下,农菁1号苜蓿比肇东苜蓿更耐盐;而300,400 mmol/L NaCl处理时,肇东苜蓿的耐盐性大于农菁1号苜蓿。     

Bar基因转化草原1号苜蓿的研究

利用农杆菌介导法将抗草丁膦的Bar基因导入草原1号苜蓿,经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性,通过多聚白酶连式反映检测,初步证实目的基因已转入到苜蓿基因组中.     

农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿的影响因素

以新牧1号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Xinmu No.1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌EHA105介导转化犁苞滨藜NHX耐盐基因,提高植株耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究,结果表明:以预培养3d的子叶为转化受体,菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.5时,浸染10～15min,然后转入附加20～30mg/L乙酰丁香酮的共培养基,培养4d,可以获得较高的转化效率;对抗性芽的PCR检测初步证明,外源基因整合到苜蓿的基因组中。     

AtNHX1基因对菊苣的转化和耐盐性研究

用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入菊苣中,共获得42株卡那霉素(Kan)抗性再生植株。经过PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测表明,AtNHX1基因已成功整合到菊苣基因组中,并且能够正常转录。野生型和转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验,结果显示,相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织。施加梯度NaCl胁迫后,植株叶片K⁺和Na⁺含量测定结果显示,转基因植株叶片比野生型积累更多的Na⁺和K⁺,维持较高的K⁺/Na⁺;叶片相对电导率测定结果表明,转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型。上述结果表明,AtNHX1基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害。     

转rstB基因苜蓿耐盐性初评(简报)

rstB基因来源于费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)耐盐菌株RT19。该基因可以使费氏中华根瘤菌盐敏感突变体RC3-3恢复耐盐性,推测该读码框编码的基因与渗透调节相关,并命名为rstB^[1]。rstB基因核苷酸序列和蛋白序列在NCBI基因Bank上同源性比对分析结果显示,rstB基因编码一糖基/苷转移酶,属于糖基/苷转移酶第二家族成员(glycosyl transferase),该酶参与细胞壁的生物学功能,为多功能酶。糖基转移酶是糖基化过程的关键酶,它的表达和细胞周期密切相关。     

转rstB基因苜蓿耐盐性评价(简报)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(以下简称苜蓿)是一种比较耐盐的豆科牧草,能在轻度盐碱地种植^[1]。rstB 基因来源于费氏中华根瘤菌耐盐菌株RT19,可使费氏中华根瘤菌盐敏感突变体RC33恢复耐盐性,推测该读码框编码的基因与渗透调节相关。rstB基因定位在细胞壁上,是一个分泌型蛋白,有在根部表达(或积累)的偏好性,属于细胞壁缔合蛋白类成员,可以提高植物的耐盐性^[2~6]。     

新牧1号苜蓿两个抗逆相关基因启动子的克隆及分析

采用实时荧光定量PCR分析了新牧1号苜蓿（Medicago varia Xinmu 1）MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达情况。此外,根据已获得的MvDREB1和MvNHX1基因序列设计特异引物,并以新牧1号苜蓿的基因组DNA为模板,克隆得到了这两个基因的启动子。利用生物信息学方法,分析这两个基因启动子的类型和结构,结果表明,MvNHX1和MvDREB1基因的启动子序列中均含有通用启动元件和上游调控元件,如CAAT框、TATA框、光响应元件、低温响应元件等,但部分响应元件的种类和数量不同。通过对两个基因启动子的克隆、分析及比较为进一步研究这两个基因的表达调控机制奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。从13份苜蓿材料中筛选出一份具有高频再生潜力的基因型一公农1号,并以该品种为受体转化Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,优化了遗传转化条件,建立了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中。     

AtSOS基因在紫花苜蓿中的表达及其耐盐性研究

本研究采用基因工程技术改良紫花苜蓿耐盐性,通过种植转基因耐盐紫花苜蓿达到改良土壤的目的。以紫花苜蓿子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将来源于拟南芥的AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3多基因表达载体导入阿尔冈金紫花苜蓿中,经PCR检测、抗除草剂筛选和RT-PCR鉴定,获得了能稳定表达的转基因株系。以转基因的紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿为材料进行盐处理,每个处理重复3次,测定其生理生化指标、株高、Na⁺和K⁺含量、细胞膜透性、叶绿素含量。结果显示,在不同盐浓度处理下,所有植株的株高均有所增长,但在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的长势显著高于野生型植株;随着处理时间的增加,所有植株的叶绿素含量均呈先上升后下降的趋势,且野生型植株叶绿素含量均低于转基因植株;在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的细胞膜透性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量的增加量均小于野生型植株,而过氧化物酶、过氧化氢酶活性和可溶性糖含量的增加量均大于野生型;各植株中丙二醛含量均下降,且野生型植株下降的更为明显;盐处理后,转基因植株根系中Na⁺的积累比野生型植株少,而K⁺的吸收多于野生型植株。转AtSOS基因的紫花苜蓿通过发挥AtSOS途径的作用,促进了植物体将细胞内的Na⁺外排,从而减轻盐胁迫对植物体的伤害,提高了转基因植株的耐盐性。     

2006年度全国草品种审定委员会审定通过的草品种名录（一）——中苜3号紫花苜蓿

品种登记号：321 草种名称：紫花苜蓿 品种名称：中苜3号 登记日期：2006年12月13日     

赤草1号杂花苜蓿

品种登记号：322 草种名称：杂花苜蓿 品种名称：赤草1号 登记日期：2006年12月13日     

水稻金属硫蛋白基因(rgMT)遗传转化的紫花苜蓿耐盐性分析

采用根癌农杆菌介导法将从水稻(Oryza sativa)中克隆出的一个金属硫蛋白基因(rgMT)转化到紫花苜蓿(Medicago sativa)品种"农菁1号"中,经PCR和Northern blot技术对获得的抗性植株进行了检测,证明rgMT基因已整合到苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。以野生型苜蓿为对照,对获得的转基因苜蓿株系在不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下的表型和生理指标测定发现,NaCl、NaHCO3胁迫处理后,野生型苜蓿受胁迫严重甚至死亡,转基因苜蓿受胁迫较轻。转基因苜蓿的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型(P0.05),细胞膜透性显著低于野生型,野生型苜蓿叶片中积累的过氧化氢高于转基因苜蓿的叶片中积累的过氧化氢。研究结果表明,rgMT基因已在苜蓿中表达,并且提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

苜蓿新品种草原4号的选育

草原4号苜蓿(Medicago sativa cv.Caoyuan No.4)是对400余份苜蓿原始材料进行抗虫性鉴定,选择优良无性系,并结合抗虫性和配合力测定组配基础群体,通过3次轮回选择育成的抗蓟马苜蓿新品种(登记号:477)。该品种根直立,具有水平生长根;茎直立,有茸毛;叶为三出复叶,表面有茸毛;花紫色;荚果螺旋2~3回;千粒重1.86~2.35g。抗虫性强(为害点系数为0.26,虫情指数为0.33)、抗旱、抗寒、耐瘠薄。在呼和浩特地区可刈割3茬,干草平均产量在12 000~16 000kg·hm~(-2),种子产量达230.90kg·hm~(-2)。粗蛋白质含量在19%左右。适宜在我国华北南部苜蓿蓟马为害严重的各省(区)种植。     

甘农3号和陇东苜蓿高效共生根瘤菌菌株的筛选

本研究结合温室盆栽和大田试验,研究了接种不同根瘤菌菌株对甘农3号(Medicago sativa cv.Gannong No.3)和陇东苜蓿(M.sativacv.Longdong)幼苗生长及结瘤特性的影响,并进一步分析了接种根瘤菌后陇东苜蓿的光合特性及其生物量构成因素的变化。结果表明,盆栽条件下,甘农3号接种17767菌株后,生物量、株高、分枝数和叶数分别增长了102%、100%、17%和18%;陇东苜蓿接种17625菌株后,生物量、株高、分枝数和叶数分别增了187%、48%、80%和47%。而在大田条件下,甘农3号接种17650菌株后,生物量和株高分别增长了21%和13%;陇东苜蓿接种17574菌株后,生物量和株高分别增长了348%和70%。盆栽条件下,相比未接种处理,接种6-3、17537、129、17670、17582、17578、17650菌株均不同程度地提高了陇东苜蓿的水分利用效率,仅接种17578、17582菌株提高了其光合速率。综合盆栽与田间试验,与甘农3号最佳共生匹配的根瘤菌菌株为B2;而与陇东苜蓿最佳共生匹配的根瘤菌菌株为17650。     

甘农6号紫花苜蓿品种选育报告

运用多次单株选择法进行甘农6号紫花苜蓿(长穗苜蓿类型)新品种的选育.从原始材料中选择穗长8cm以上的优良植株,采取扦插繁殖建立无性株系产生种子,经多次单株选择建立株系,并进行株系比较、品系比较和品种比较.结果表明,甘农6号生育期与对照德福、甘农1号一致,其株高、生长速度、再生强度和种子产量明显高于对照,种子千粒重低于对照,是具有种子高产潜力的新品种.     

日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

为研究日本结缕草ZjADH基因是否与植物耐寒有关,通过DNA重组技术将ZjADH基因插入3302Y质粒中,成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH,通过农杆菌介导的花序侵染法获得具有草铵膦抗性的转基因植株。PCR和qRT-PCR鉴定表明,目的基因已整合入拟南芥基因组中并能够成功表达。对野生型和转基因拟南芥进行低温(4 ℃)处理和耐寒分析,结果表明,转基因拟南芥对低温胁迫的抵抗能力明显高于未转基因植株。在低温胁迫下,转基因拟南芥中脯氨酸的含量显著高于野生型植株,而活性氧的积累明显低于野生型植株;对转基因植物抗性相关基因的表达分析显示:转基因植物体内SOD、APX及LEA基因的表达水平明显高于未转基因植株,说明ZjADH基因可能通过提高转基因植物体内SOD、APX及LEA的表达活性来增强植物的抗寒性。综上所述,日本结缕草ZjADH基因的表达能够提高转基因植株的耐寒性,对ZjADH基因的研究也为进一步获得抗寒转基因日本结缕草植株奠定理论依据。     

紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因的表达及抗逆性分析

根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(MET1, 登录号:AF189766.1)cDNA序列设计一对特异性引物,以紫花苜蓿品种“农菁1号”的cDNA为模板,利用PCR技术克隆出的一个基因,命名为MsMT1,测序发现该基因全长228 bp,编码75个氨基酸。通过碱基序列比对发现MsMT1与MET1的相似度为99%。通过氨基酸序列分析和进化树分析,发现与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性。利用qRT-PCR对MsMT1在苜蓿不同器官中的表达进行分析,发现该基因在根和子叶中表达量较高。将苜蓿幼苗进行不同浓度NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃及不同pH值胁迫处理后, 观察MsMT1基因的表达,发现MsMT1的表达量随盐碱处理液浓度和pH值变化发生改变,说明MsMT1与植物的抗逆性相关。采用农杆菌介导法将MsMT1导入苜蓿植株体内,卡那抗性的筛选和Northern blot结果显示MsMT1基因能够在转基因苜蓿中高效表达。用不同浓度NaCl、NaHCO₃处理野生型和转化MsMT1基因的苜蓿幼苗,观察幼苗受胁迫后的表型,发现转基因的苜蓿幼苗比未转基因的苜蓿幼苗抵抗力高。本研究表明MsMT1基因能够增加苜蓿对胁迫的抗性。