中华大节竹耐盐基因Is SOS1的克隆与序列分析

通过RACE技术,从中华大节竹根中克隆出一个质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因,并命名为Is SOS1(基因登录号:KC113048)。Is SOS1序列分析结果显示,Is SOS1的全长为3 516 bp,其中开放读码框为3 105 bp,编码了1 035个氨基酸多肽。氨基酸同源性和聚类分析证实,Is SOS1氨基酸序列与拟南芥At SOS1和水稻Os SOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为50. 3%和76. 63%,但是与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列同源性较低。     

油桐油体蛋白基因的克隆及序列分析

油桐油体蛋白与油桐脂肪酸储藏密切相关。通过构建油桐cDNA文库和EST文库,用分子生物学手段分离克隆出两个油桐油体蛋白基因的全长cDNA序列。通过分析表明,两个油体蛋白基因的全长cDNA分别为738 bp、838 bp,各包含1个完整的CDS,分别编码137个、154个氨基酸。分别命名为VF_oleⅠ,VF_oleⅡ。通过与其它物种的19条油体蛋白氨基酸序列比对,油桐油体蛋白基因分别与麻疯树oleosin 3和麻疯树oleosin 2的相似性最高,分别为84%、82%。通过软件预测表明,油桐油体蛋白等电点分别为10.315、10.335,都存在跨膜结构域,且存在信号肽剪切位点,中部都存在一个较长的疏水区,C末端都是以α-螺旋为主。     

马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)克隆及分析

对马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)进行扩增、克隆和测序(GenBank登录号:EU753854).应用MEGA4.0.2软件对不同树种CCR基因的核苷酸和氨基酸序列进行比对,结果表明:马尾松CCR基因的外显子和内含子数目与火炬松、杨树、银合欢、光皮桦、冈尼桉、柳桉、蓝桉的外显子和内含子数目相同,都有5个外显子和4个内含子.马尾松CCR基因编码区975 bp,编码324个氨基酸.马尾松外显子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ分别为133,155,186,353,148 bp,而内含子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ分别为1 450,216,737,941 bp.马尾松CCR外显子和内含子连接处序列除内含子Ⅱ/外显子Ⅲ出现CTPuCG/外显子Ⅲ,其余遵循外显子/GTPuAG/外显子组成规律.马尾松外显子Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ核苷酸数目与桉属、杨属、桦木属和松属树种相同,但外显子Ⅰ和外显子Ⅴ不尽相同.比对的树种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上相对保守,也存在一定差异.马尾松与火炬松、光皮桦、银合欢、杨树、冈尼桉、柳桉、蓝桉各物种间编码区核苷酸序列相似性大小分别为99.2%,67.8%,68.0%,68.9%,69.5%,69.3%,69.9%,而相应的氨基酸序列间相似性大小分别为99.1%,73.5%,72.5%,74.4%,75.0%,74.4%,75.0%.马尾松与其他13个树种CCR序列构建的系统进化树表明:3个针叶树种形成1个独立分支,而且最早进化.     

竹子捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术与RACE技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA,命名为cab-BO1(GenBank登记号:EF061137).该基因长1 102 bp,从第64～861 bp含有1个开放阅读框,编码265个氨基酸.cab-BO1编码的氨基酸中第64～232位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,第9～11位为蛋白激酶C的磷酸化位点,第27～52位为泛素结构功能域信号,第55～58位为酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位点.序列相似性分析结果表明:cab-BO1 DNA序列和编码的氨基酸序列与玉米、小果野蕉、小麦、水稻等的cab基因及其氨基酸序列的相似性分别在85%和89%以上,显示了cab家族基因在进化过程中的保守性.     

板栗CmAPs基因的克隆及在芽变短雄花序中的表达分析

利用RT-PCR与RACE扩增方法,分别从板栗正常雄花序和芽变短雄花序cDNA中分离出编码板栗天冬氨酸蛋白酶cDNA全长的序列,序列分析表明:克隆的cDNA片段总长分别为1 822 bp和1 909 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小均为1 539 bp,可编码长度为513个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与蓖麻、可可和葡萄的天冬氨酸蛋白酶的蛋白质氨基酸序列相似性分别为83%,80%和75%.正常与芽变短雄花序中天冬氨酸蛋白酶的氨基酸序列存在6个氨基酸的差异,其中有3个位于活性区.后证实分离出的2个天冬氨酸蛋白酶基因在正常雄花序和芽变短雄花序中共同存在,命名为CmAPs1和CmAPs2(GenBank登录号分别为GQ984143和GQ084144).实时荧光定量PCR结果显示:在雄花序原基形成期、花簇原基形成期和花朵原基形成期,芽变花序中的CmAPs的总表达量均高于正常花序中的总表达量,而在发育的花被原基形成期即程序性死亡发生期,CmAPs在芽变花序中表达量远远低于正常花序中表达量.初步推测CmAPs与短雄花序发育过程中的程序性死亡有关.     

美洲黑杨雄性花芽cDNA克隆测序及表达序列标签(ESTs)特性分析

采用SMART技术构建美洲黑杨雄性花芽cDNA文库.随机挑选4 200个克隆进行序列测定,获得原始序列3 092个ESTs,去除插入片段短于150 bp的序列和污染序列后,获得有效ESTs序列3 087个,平均长度515 bp.对聚类后的416个Clusters分别进行单独拼接,得到相应的Contigs和Singletons分别为451和1 104个,并通过与NCBI等核酸数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能和未知功能的基因1 015个,无序列相似性的新基因540个.这些数据为进一步研究高等植物花发育提供了一个极有价值的资源.     

油茶脂氢过氧化物裂解酶基因的克隆与序列分析

以油茶近成熟种子为材料,根据油茶EST文库中已知的脂氢过氧化物裂解酶EST序列,利用3’RACE与5’RACE技术,克隆到脂氢过氧化物裂解酶的全长cDNA序列。该基因全长1648bp,,包含一个1476bp开放阅读框长,编码491个氨基酸,5’与3’非编码分别为52bp、121bp。预测该蛋白相对分子量为54.7779KDa,等电点为6.77,是个叶绿体转运肽,N端包含有22个疏水氨基酸残基组成的序列,不仅具有转运肽富含的丝氨酸,还含有大量转运肽中很少存在的脯氨酸。多序列比对发现油茶脂氢过氧化物裂解酶核苷酸序列与茶的相似性达到96%,因此将该基因命名coHPL。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

中华大节竹K~+通道蛋白β亚基的克隆及序列分析

用RACE法从中华大节竹幼苗中克隆了K+通道蛋白β亚基,命名为KIB1(基因登录号:JX900132)。序列分析表明,该基因全长1 211 bp,开放读码框为987 bp,编码329个氨基酸多肽。经氨基酸同源性和聚类分析证实,KIB1与拟南芥(KAB1)和水稻(KOB1)钾离子通道蛋白的序列同源性较高,其同源性分别为85.06%和82.32%。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在于线粒体中(86.1%)。     

杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出HDR基因的cDNA克隆,命名为EuHDR。EuHDR基因cDNA全长1 653 bp,5’端非编码区长82 bp,3’端非编码区长188 bp,编码460个氨基酸,与喜树HDR基因序列相似性最高,达82%;推导EuHDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A33)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A117,A208,A262,A345);EuHDR蛋白二级结构α-螺旋占35.65%,β-折叠占19.78%,螺环结构占44.57%;EuHDR蛋白三级结构为单体形式,呈不规则的三叶草形状;系统进化分析表明EuHDR蛋白与葡萄HDR蛋白的亲缘关系最为接近。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

牡丹PsAP2基因的克隆及表达

以牡丹品种‘赵粉’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得1个牡丹APETALA2基因cDNA全长,命名为PsAP2,GenBank登录号为HM167511。序列分析结果表明:PsAP2全长2138bp,包含47bp的5'非编码区、557bp的3'非编码区和1个长度为1533bp编码510个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因属于AP2家族。序列比对和系统进化分析表明,PsAP2与葡萄的亲缘关系最近,相似性达70%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsAP2在根、茎、叶和四轮花器官中均有表达。花瓣中的表达量最高,叶片中表达量最低。     

泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并 PCR扩增河北平山株系 PaWBPs 和江西吉安株系 PaWBJan 的 tmk 基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明：从 PaWBPs和 PaWBJan中克隆测序的93条和41条 tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF 可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3; PaWBPs有5个相同的 tmk-a-1序列与 PaWBJan的一个 tmk-a-1序列及枣疯植原体 tmk-Y 序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%; tmk-b基因为单一序列,两株系的 tmk-b核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和 TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而 tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。     

油桐LEAFY同源基因片段的克隆与分析

根据不同植物LEAFY（LFY）同源基因序列的保守区,设计合成1对简并引物,利用该引物通过PCR技术从油桐基因组DNA中分离出1条长约1050bp的LFY同源基因（TUNGlfy）片段,克隆到pMD18-T载体,以期为进一步研究LFY基因表达特性及其与油桐成花生物学的关系打下基础.进行测序和生物信息学分析的结果表明,该片段长1059bp,在中间有1个长639bp的内含子,前面的外显子长294bp,后面的长126bp,共编码135个氨基酸,拼接位点与其它植物的LFY同源基因一致;其推导蛋白质序列与其它植物LFY同源基因的相似性为88%～97%,其中与毛白杨的相似性最高,达到了97%,推测它们具有相似的功能.     

金桂芳樟醇合成酶基因的克隆与序列分析(英文)

以金桂的花器官为试材,设计芳樟醇合成酶基因简并引物,通过逆转录PCR、快速扩增cDNA末端技术和Blastn分析等,获得金桂芳樟醇合成酶基因的全长cDNA序列,命名为OfLis(Osmanthus frangrans vat.thunbergii linaiool synthase,GenBank登录号FJ645727).OfLis,基因全长cDNA长度为2 003 bp,包含1个1 731 bp的开放阅读框,编码576个氨基酸.序列分析表明:OFLis具有单萜烯类合成酶基因典型的保守结构域,即DDXXD和(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE;具有多数单萜烯类合成酶活性必需的RR(X)8W功能基团.OfLis推导氨基酸序列的预测分子质量和等电点分别为67.29 ku和5.26;疏水性分析结果表明其大部分氨基酸区域为亲水结构.氨基酸水平上,OfLis与薰衣草芳樟醇合成酶基因的相似性最高,为63.6%,与山字草芳樟醇合成酶基因的相似性最低,为19.0%.逆转录PCR结果表明:整个花期内OfLis基因在花瓣、雌蕊和雄蕊中均有表达,而在萼片和叶片中不表达.研究结果为香味植物的育种、品种改良及香味成分的调控提供理论基础.     

白蜡虫β1-微管蛋白基因cDNA克隆及序列分析

采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。     

紫花苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因同源克隆与序列变异分析

β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一。采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3。其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大。序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力。β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(2~(21))。这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、外部环境条件。     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

杨树ARGONAUTE基因的克隆及序列分析

作为RNA诱导沉默复合体的核心元件,Argonaute(AGO)蛋白在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以欧美杨和美洲黑杨不定根cDNA为模板,采用RT-PCR技术分离得到PeAGO5和PdAGO5基因的cDNA克隆,测序和序列分析结果表明2个目的cDNA片段均为2809bp,基因内部含有完整的开放阅读框,可编码907个氨基酸,预测蛋白质分子量分别为102.31ku和102.34ku,理论等电点(pI)分别为9.34和9.7。所推导的2个氨基酸序列之间仅有7个差异位点,含有3个保守的结构域,DUF1785、PAZ和Piwi结构域。它们与拟南芥AtAGO5蛋白的相似性分别为64.8%和64.3%,故将其命名为PeAGO5和PdAGO5。系统进化分析发现,PeAGO5和PdAGO5,与拟南芥AtAGO1,AtAGO5和AtAGO10蛋白同属一个进化分支。此外,采用实时定量PCR技术检测PeAGO5基因在杨树硬枝插穗不定根发育过程中的表达模式,推测该基因参与不定根发育调控。     

哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因SA76的3＇RACE扩增和序列分析

由EST获得全长cDNA对于结构基因组学和功能基因组学都是至关重要的,cDNA末端快速扩增技术RACE是该领域中的重要研究方法.利用BD SMART RACE技术扩增编码分泌天冬氨酸蛋白酶SA76基因的3＇末端,将其与哈茨木霉cDNA文库中的SA76基因的EST序列进行序列拼接,获得2019bp的全长cDNA序列,其开放读码框长1593bp,5＇非编码区266bp,3＇非编码区201bp,编码530个氨基酸,有信号肽.哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因与玉蜀黍赤霉、粗糙脉孢菌、球毛壳菌天冬氨酸蛋白酶基因的同源性分别为53%, 37%, 36%.利用BD SMART RACE技术首次从哈茨木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因,为验证SA76基因的功能奠定基础,为进一步研究蛋白酶的作用机制及生物防治功能提供依据.