GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞系）的凋亡效应及睾酮合成的调节作用。从6~8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平。结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高（P<0.01）,表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达。转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高（P<0.01）,凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高（P<0.01）。与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低（P<0.01）。与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 scc mRNA表达量极显著降低（P<0.01）,StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低（P<0.05）,17β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异（P>0.05）。综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GnIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用。本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据。     

猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养，将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组（16~22 h）与晚期卵裂组（26~32 h）统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明，猪孤雌激活胚胎在16~22 h发生卵裂的为50%~60%，而26 h之后发生卵裂的不到20%，在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%，42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组（P<0.05）。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组（P<0.05），Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组（P<0.01），Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组（P<0.01），而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎（26~32 h）显著上调（P<0.05）。结果显示，初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

促性腺激素抑制激素对SD大鼠性腺生殖功能与糖代谢的影响

【目的】 探究促性腺激素抑制激素（GnIH）对SD大鼠性腺生殖功能和糖代谢的影响,以及SD大鼠性腺生殖功能和糖代谢之间的相关性。【方法】 将36只SD大鼠随机均分为对照组（0.9％生理盐水）、1 μg/100 μL GnIH组（Ⅰ组）、10 μg/100 μL GnIH （Ⅱ组）,每组12只（雌雄各半）。每天07：00和19：00注射生理盐水或GnIH （200 μL/次）,连续注射14 d后测量大鼠体重,计算肥胖程度,麻醉处死后采集卵巢和睾丸,称重并计算卵体比和睾体比;运用阴道涂片法观察雌性大鼠发情周期的变化;显微镜下观察并计算雄性大鼠精子活力;HE染色观察卵巢和睾丸组织变化;用实时荧光定量PCR法检测卵巢和睾丸中糖代谢基因胰岛素受体（IR）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）和炎症相关因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）的表达水平,并用SPSS 22.0软件分析生殖功能和糖代谢之间的相关性。【结果】 与对照组相比,Ⅰ组雌性SD大鼠和Ⅱ组雄性SD大鼠肥胖程度均显著升高（P<0.05）;Ⅱ组卵巢大小/重量、卵体比显著升高,睾丸重量、睾体比显著下降（P<0.05）。HE染色结果显示,与对照组相比,Ⅱ组雌性大鼠卵泡呈囊性扩张,颗粒细胞层减少,卵泡腔变大;Ⅰ、Ⅱ组雄性大鼠的生精小管均出现空泡样改变,生精细胞排列紊乱、层次减少。与对照组相比,Ⅱ组大鼠发情前期的持续时间显著延长（P<0.05）、精子活力显著下降（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组雌性大鼠GLUT4基因的表达量极显著下降（P<0.01）、Ⅱ组中IR基因的表达量显著降低（P<0.05）,Ⅰ、Ⅱ组雄性大鼠GLUT4基因的表达量均极显著降低（P<0.01）;Ⅰ组雌性大鼠TNF-α、IL-1β基因和雄性大鼠IL-1β基因的表达量均显著升高（P<0.05）,Ⅱ组雌、雄大鼠TNF-α基因的表达量均极显著升高（P<0.01）。相关性分析结果显示,腹腔注射GnIH后,雌性大鼠的卵体比与GLUT4基因表达水平呈极显著正相关（P<0.01）,与IR基因的表达水平呈显著正相关（P<0.05）;雌性大鼠的发情周期与GLUT4基因表达水平呈极显著负相关（P<0.01）;雄性大鼠睾体比与GLUT4基因表达水平均呈显著正相关（P<0.05）,而精子活力与GLUT4基因表达水平均呈极显著正相关（P<0.01）。【结论】 腹腔注射GnIH能够抑制大鼠的生殖功能和导致糖代谢功能紊乱,而且GnIH可能参与性腺能量代谢与生殖功能的交叉对话,是能量代谢与生殖功能的新型联络因子。     

HOTAIR与山羊皮肤黑色素沉积的关系及体外表达规律的研究

旨在探讨山羊HOX转录反义RNA（HOTAIR）及其部分家族基因与山羊皮肤黑色素沉积的关系以及它们在黑色素细胞中的表达规律。本研究采用qRT-PCR检测HOTAIR和HOXD10、HOXC11、HOXC12基因在健康成年雌性酉州乌羊（（19.16±1.44）kg）、板角山羊（（23.27±3.24）kg）皮肤组织中的mRNA水平，及其在小鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16-F10）增殖、分化过程中（培养1、3、5和7 d）的表达模式，并分析HOTAIR与其他3个基因表达的相关性。结果显示，在皮肤组织中，酉州乌羊HOTAIR和HOXC12的相对表达量极显著高于板角山羊（P<0.01），酉州乌羊HOXD10的相对表达量显著低于板角山羊（P<0.05）；HOTAIR与HOXC12表达显著正相关（P<0.05），与HOXD10表达显著负相关（P<0.05）。在B16-F10细胞增殖阶段，HOTAIR在各阶段表达差异不显著（P>0.05），HOXC11、HOXC12和HOXD10呈"高-低-高"的表达模式，且均在培养1 d的相对表达量极显著高于3和5 d（P<0.01）；HOTAIR与HOXC11表达呈极显著正相关（P<0.01）。在B16-F10细胞分化阶段，HOTAIR表达持续上升，HOXD10表达持续下降，HOXC11在各阶段的相对表达差异不显著（P>0.05），HOXC12在培养1和5 d的相对表达量极显著高于3和7 d（P<0.01）；HOTAIR与HOXD10表达极显著负相关（P<0.01）。HOTAIR在乌皮山羊皮肤中高表达，在B16-F10细胞分化阶段的表达随着培养时间的延长而增加，HOTAIR对HOXD10存在负向调控作用。HOTAIR与HOXD10互作可能调控山羊皮肤黑色素细胞的分化与黑色素生成。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

H2S暴露对保育猪氧化还原状态及硫化氢代谢的影响

本试验旨在研究硫化氢（H₂S）暴露对保育猪氧化还原状态及内源性H₂S代谢的影响。试验选取12头体况健康、体重相近（（11.61±1.51） kg）的35日龄大白猪,随机分为2组并分配到2个环控舱内,公母各半,每组6头猪。试验组环控舱内H₂S浓度控制为30 mg·m^-3,对照组环控舱内H₂S浓度控制为0 mg·m^-3,试验期28 d。试验结束后采集血清和肝组织样品,检测氧化还原和H₂S代谢相关指标。结果显示,与对照组相比：1）血清中ROS含量极显著增加（P<0.01）,MDA含量显著增加（P<0.05）;抗氧化酶T-SOD活性显著降低（P<0.05）,CAT和GPX活性极显著降低（P<0.01）;非酶抗氧化物GSH和GSSG含量无显著变化（P>0.05）。2）肝中T-SOD和GPX活性极显著升高（P<0.01）,·OH清除能力显著提高（P<0.05）;ROS、H₂O₂、PC、MDA、GSH、GSSG含量无显著差异（P>0.05）。3）肝中Keap1的mRNA表达量显著下调（P<0.05）,Nrf2的mRNA表达量显著上调（P<0.05）;抗氧化相关基因（SOD2、GPX1、GPX2、GPX4和GSR）的mRNA表达量显著上调（P<0.05）。4）血清和肝中H₂S含量显著降低（P<0.05）;肝内源H₂S合成酶CSE和CBS的mRNA表达量显著下调（P<0.05）,3-MST的mRNA表达量无显著变化（P>0.05）;肝H₂S分解代谢酶SQR和SUOX的mRNA表达量下调,但差异不显著（P>0.05）。结果表明,30 mg·m^-3 H₂S暴露导致保育猪血清抗氧化系统受损,而肝中Nrf2/Keap1信号通路的激活使肝免受氧化损伤;此外,H₂S暴露抑制了保育猪内源性H₂S的合成代谢。     

阿勒泰羊生长速度与主要血液生化指标含量及尾脂Leptin基因表达关系

试验通过研究不同生长速度阿勒泰羊主要血液生化指标含量和尾脂中瘦素（Leptin）基因的表达水平，探讨阿勒泰羊生长速度与脂肪沉积之间的关系。选取300只出生时间相近的阿勒泰羊公羔，正常饲喂至6月龄，记录日增重，取平均日增重排前10%和后10%的公羔各30只，分为生长快速组（HBW）和生长慢速组（LBW），从生长快速组随机选12只分为抑制生长组（饲喂低能量饲粮以抑制其生长，HBW-75%，n=6）和生长快速对照组（饲喂标准饲粮，HBW-100%，n=6），生长慢速组随机选12只分为促进生长组（饲喂高能量饲粮以促进生长，LBW-125%，n=6）和生长慢速对照组（饲喂标准饲粮，LBW-100%，n=6）；预饲期7 d，正饲期30 d，试验结束后称重并采集血液，屠宰后采集尾部脂肪。检测血液TG、CK、TSH、T3、T4、S.S、GH、INS、PG、Leptin含量或活性及尾部脂肪Leptin mRNA和蛋白表达量，并观察尾部脂肪细胞形态学变化。结果显示，HBW-100%和LBW-100%组初体重与末体重均差异显著（P<0.05），HBW-75%和HBW-100%组初体重与末体重均无显著差异（P>0.05）；LBW-100%和LBW-125%组初体重差异显著（P<0.05），末体重无显著差异（P>0.05）。LBW-100%组的T4、S.S、Leptin、TSH、T3含量显著低于HBW-100%组（P<0.05）；LBW-125%组T3含量显著高于LBW-100%组（P<0.05）；HBW-75%组GH、PG和Leptin含量显著低于HBW-100%组（P<0.05）。LBW-125%组尾部脂肪细胞面积大于LBW-100%组，HBW-75%组小于HBW-100%组（P<0.05）。Leptin mRNA和蛋白表达量检测结果表明，HBW-100%组的Leptin mRNA表达量与LBW-100%组无显著差异（P>0.05），Leptin蛋白表达量极显著高于LBW-100%组（P<0.01）。LBW-125%组Leptin mRNA和蛋白的表达量均显著高于LBW-100%组（P<0.05）。HBW-75%组Leptin mRNA的表达量极显著低于HBW-100%组（P<0.01），Leptin蛋白表达量显著低于HBW-100%组（P<0.05）。综上所述，生长快速组与生长慢速组中，Leptin的表达量与体重和体脂有一定关联；在生长慢速组促进生长后体重和体脂显著增加，Leptin的表达量呈上升趋势；在生长快速组抑制生长后体重和体脂减少，Leptin的表达呈下降趋势。改变生长速度对Leptin的表达量会产生影响，从而改变机体的脂肪沉积状况。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

中草药对断奶仔猪生长性能影响的Meta分析

利用Meta分析方法对已发表的中草药在断奶仔猪阶段应用试验研究进行评价,为断奶仔猪保健治疗提供参考。通过计算机检索CNKI、Wanfang Data、Science Direct、Web of Science、VIP数据库,全面收集中草药在断奶仔猪阶段添加的对照试验。采用Cochrane协作网推荐的Review Manager 5.3软件对各效应指标进行Meta分析。共纳入27篇文献,1 870头仔猪,试验组935头,对照组935头,试验组均采用中药治疗,对照组采用金霉素、硫酸黏杆菌素、硫酸黏杆菌素+杆菌肽锌等抗生素治疗。结果显示：中药组对日增重的影响优于整体抗生素组[SMD=1.22,95% CI（0.69~1.75）,P<0.01],但与金霉素组统计学无差异（P>0.05）;中药组日采食量优于整体抗生素组[SMD=0.77,95% CI（0.34~1.20）,P<0.01],但与金霉素组作用相当（P=0.05）;中药组和抗生素组的料重比差异不显著[SMD=-0.35,95% CI（-0.78~0.09）,P=0.12>0.05],但显著优于硫酸黏杆菌素和金霉素亚组（P<0.01）;中药组的腹泻率极显著低于抗生素组{SMD=-1.77,95% CI[-2.52~（-1.01）],P<0.01},但与硫酸黏杆菌素+杆菌肽锌组相比,效果相当（P>0.05）。仔猪断奶阶段添加中草药,在日增重、日采食量、腹泻率指标上优于抗生素组,即中药在断奶仔猪阶段研究具有重要潜力。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

不同精粗比饲粮对绵羊瘤胃体外发酵和共轭亚油酸产量的影响

【目的】在添加2%豆油基础上研究不同精粗比饲粮对绵羊瘤胃体外发酵和共轭亚油酸产量的影响。【方法】试验共设7个饲粮精粗比组(精粗比分别为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2),称取300 mg不同精粗比饲粮于尼龙袋中,并添加2%豆油于玻璃发酵管中,吸取30 mL培养液,体外发酵48 h,每种精粗比设4个平行,并进行2次重复试验。【结果】(1)4∶6组乙酸浓度最高且极显著高于其他各组(P<0.01)。戊酸浓度随精粗比比值增加先增加后降低,4∶6组显著高于6∶4组和7∶3组(P<0.05)。4∶6组总挥发性脂肪酸浓度显著高于2∶8组、3∶7组、6∶4组、7∶3组(P<0.05)。其他处理组之间丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸浓度和乙酸∶丙酸比例均无显著差异(P>0.05)。8∶2组瘤胃液pH最高。(2)4∶6组干物质降解率显著高于3∶7和5∶5组(P<0.05)。4∶6组甲烷产量最低,且极显著低于6∶4组(P<0.01)。6∶4组总产气量显著高于2∶8、3∶7和5∶5组(P<0.05),但与4∶6组无显著差异(P>0.05)。(3)...     

芝麻素对小鼠早期胚胎体外发育的影响

本试验旨研究在体外培养（in vitro culture，IVC）中添加芝麻素（sesamin，SES）对小鼠早期胚胎体外发育的影响。采集6周龄雌性昆明小鼠受精卵，随机分为对照组和不同浓度（10、50、100 μmol/L）SES组。采用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342免疫荧光染色分别检测囊胚内细胞凋亡率和总细胞数；采用DCFH-DA检测早期胚胎内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用CMF₂HC检测早期胚胎内谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；采用JC-1检测早期胚胎线粒体膜电位强度。结果显示，不同浓度SES组分裂率和囊胚率较对照组均有提高，但无显著差异（P>0.05）；50 μmol/L SES组细胞数较对照组显著提高（P<0.05），细胞凋亡率较对照组显著降低（P<0.05）；与对照组相比，50 μmol/L SES组ROS水平显著降低（P<0.05），GSH水平和线粒体膜电位水平显著提高（P<0.05）。结果表明，在IVC中添加SES可提高囊胚内细胞数、减少细胞凋亡率，降低细胞内ROS水平，提高细胞内GSH水平，改善早期胚胎线粒体功能，减少胚胎氧化应激的损伤，提高小鼠早期胚胎发育质量。     

胎牛血清在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用研究

【目的】研究胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用。【方法】本试验以体外培养第5天的猪孤雌激活囊胚为材料,将新鲜和冷冻囊胚分别在含10%FBS(V/V)的胚胎培养液中继续培养48 h,即分为新鲜组(Fresh)、新鲜+FBS组(Fresh+FBS)、冷冻组(Vitrified)、冷冻+FBS组(Vitrified+FBS)。观察各组囊胚的扩张和孵化能力,检测胚胎的细胞膜损伤、凋亡细胞数目、总细胞数目、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体活性以及发育相关基因的表达水平。【结果】与Fresh和Vitrified组相比,Fresh+FBS和Vitrified+FBS组的完全扩张率、孵化率和囊胚细胞总数均显著提高(P<0.05),细胞膜损伤率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。与Fresh组相比,Vitrified组ROS水平显著升高(P<0.05),Fresh+FBS和Vitrified+FBS组ROS水平均显著降低(P<0.05)。Vitrified+FBS组的线粒体活性显著高于Vitrified组(P&l...     

光照周期对褪黑激素受体在母兔下丘脑-垂体-卵巢轴中分布与表达的影响

旨在观察不同光照周期对新西兰白色母兔褪黑激素受体在"下丘脑-垂体-性腺轴"中的分布和表达模式,从而进一步分析褪黑激素在不同光照周期下调控母兔发情的机制。选用5月龄未经产新西兰母兔48只,随机分成3组,每组16只,前10 d各试验组采用"12 h光照：12 h黑暗"的光照制度,后6 d分别采用长光照（16 h光照：8 h黑暗）、短光照（8 h光照：16 h黑暗）和正常光照（12 h光照：12 h黑暗,对照组）的光照制度,光照强度80 lx,试验期为16 d。试验结束后剖杀动物,取下丘脑、垂体和卵巢,用qPCR、免疫印迹、免疫组织化学方法,研究不同光照周期对母兔的下丘脑、垂体、卵巢中褪黑激素受体亚型分布与表达的影响。结果表明：在下丘脑,短光照组的MT1 mRNA表达量较长光照组高88.8%（P<0.05）,较对照组高54.9%（P<0.05）,长光照组与对照组间无显著差异;MT2 mRNA表达量在不同光周期组间差异不显著（P>0.05）。免疫组织化学染色结果显示,长光照组下丘脑室周核的MT1阳性细胞数明显较短光照组少69.4%（P<0.05）,较对照组少37.3%（P<0.05）,短光照组比对照组显著多104.8%（P<0.05）;同样,长光照组室旁核的MT1阳性细胞数明显较短光照组少52.9%（P<0.05）,对照组明显较短光照组少55.8%（P<0.05）,而长光照组与对照组间差异不显著（P>0.05）。在垂体,短光照组的MT1 mRNA表达量比长光照组显著高164%（P<0.05）,比对照组显著高49.5%（P<0.05）,而长光照组比对照组显著低43.5%（P<0.05）;但不同光周期下MT2 mRNA表达量差异不显著（P>0.05）;长光照组的卵巢MT1 mRNA表达量较对照组低33.3%（P<0.05）,较短光照组低53.6%（P<0.05）,短光照组与对照组间差异不显著（P>0.05）;卵巢中短光照组MT2的mRNA相对表达量比对照组显著高90.0%（P<0.05）,比长光照组显著高100%（P<0.05）,长光照组与对照组差异不显著（P>0.05）。短光照周期显著提高了下丘脑、垂体和卵巢中褪黑激素受体亚型MT1表达,而不是MT2受体亚型。光照周期调控母兔发情的作用机制可能是褪黑激素通过MT1受体途径实现的。     

糖基翻转酶gtcA基因缺失降低单增李斯特菌1/2a血清型菌株致病性的研究

【目的】 构建糖基翻转酶gtcA基因缺失株，并阐明其对单增李斯特致病性的影响。【方法】 利用同源重组技术构建gtcA基因缺失株；进一步分析亲本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回补株CΔgtcA的生长能力；通过Western blotting分析gtcA基因缺失对InlA和InlB在细菌表面锚定的影响；通过DF1细胞黏附侵袭试验、RAW264.7细胞吞噬增殖试验和鸡胚毒力试验评估gtcA基因缺失对单增李斯特菌细胞侵染能力及对鸡胚致病性的影响。【结果】 生长曲线显示，gtcA基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。Western blotting结果显示，内化素InlB在ΔgtcA表面的锚定量极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.01），但其表面InlA的锚定量与EGDe-prfA*并无显著差异（P>0.05）。细胞黏附侵袭试验结果显示，ΔgtcA对成纤维细胞DF1的平均黏附率和侵袭率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05）。吞噬试验结果显示，巨噬细胞RAW264.7对ΔgtcA的平均吞噬率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05），但ΔgtcA与EGDe-prfA*、CΔgtcA在RAW264.7中的3 h内增殖倍数并无显著差异（P>0.05）。鸡胚毒力试验结果显示，ΔgtcA感染鸡胚肝脏和脾脏中的平均细菌载量分别为6.86×10³和3.69×10² CFU，极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚（P<0.01）；同时，ΔgtcA感染鸡胚存活率及存活时间均高于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚。【结论】 糖基转移酶gtcA基因缺失不影响单增李斯特菌1/2a血清型菌株EGDe-prfA*的生长能力，但能显著降低该菌表面InlB的锚定丰度，减弱该菌的细胞侵染能力及对鸡胚的致病性。本研究结果为深入探索糖基翻转酶基因gtcA介导单增李斯特菌致病机制提供参考。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。     

卵母细胞来源对水牛体细胞核移植胚胎发育潜能的影响

【目的】探索不同来源卵母细胞对体细胞核移植(SCNT)重构胚的发育能力及发育潜能关键蛋白表达水平的影响。【方法】试验分为活体采卵(OPU)和屠宰场(SLH)卵巢2组,OPU组用超声波活体采卵仪穿刺抽吸10头非泌乳期经产水牛卵巢的卵泡采卵,SLH组从屠宰场卵巢抽吸卵泡采卵。获得的卵母细胞分别进行体外成熟,体外成熟22～24 h后,吹打去除卵丘细胞,挑选具有第一极体的卵母细胞,去核后与水牛耳部成纤维细胞进行SCNT,分别统计SCNT重构胚的融合率、分裂率和囊胚率,用免疫荧光检测2种SCNT重构胚的E-钙黏蛋白(E-cadherin)和转录因子Sox2蛋白的表达水平。【结果】OPU组卵母细胞成熟率及其SCNT重构胚的囊胚率均显著高于SLH组(P<0.05),但2组SCNT重构胚的融合率和分裂率均无显著差异(P>0.05);免疫荧光结果显示,E-cadherin蛋白定位于细胞膜上,Sox2蛋白分布在细胞核膜及细胞质中,OPU组SCNT重构胚中E-cadherin和Sox2的表达水平均显著高于SLH组(P<0.05)。【结论】活体采集的水牛卵母细胞更适合用于SCNT重构胚的构建...     

RFRP-3对猪卵母细胞体外成熟的影响

旨在研究RFRP-3对猪卵母细胞体外成熟的影响。本研究采用从屠宰场收集健康母猪的卵巢中挑取的GV期卵母细胞,随机分为3组,在培养基中分别添加0、10^-6和10^-8mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞44 h后统计各组卵母细胞的成熟率;在后续试验中将收集到的卵母细胞随机分为2组,在培养基中分别添加0和10^-8 mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞44 h,观察猪卵母细胞的卵丘扩展情况并计算各组的卵丘扩展指数和各组卵母细胞的成熟率;利用qRT-PCR检测卵丘扩展因子(PTGS2、HAS2、PTX3)、卵母细胞分泌因子(GDF9、BMP15)和周期蛋白相关基因(CCNB1和CDK1)的表达变化;利用ELISA试剂盒检测MPF和cAMP的含量;采用放射免疫法检测孕酮和雌激素的浓度,每组卵母细胞量不少于100枚,每个试验重复3次。结果表明,与对照组相比,添加10^-8mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞可极显著降低卵母细胞的成熟率(P<0.01);通过显微镜观察并计算卵丘扩展指数发现,试验组中卵丘扩展无明显变化(P>0.05),但卵丘扩展因子(PTGS2、HAS2、PTX3)的表达极显著下降(P<0.01);RFRP-3可以极显著降低猪卵母细胞MPF的含量(P<0.01),对cAMP的含量无显著影响(P>0.05);添加RFRP-3可促进GDF9(P<0.01)和BMP15(P<0.05)的表达,抑制CCNB1(P<0.05)和CDK1(P<0.05)的表达;同时试验组培养基中孕酮、雌激素的浓度也极显著下降(P<0.01)。综上,RFRP-3通过调控猪卵母细胞成熟相关因子和卵丘扩展因子的表达以及类固醇激素的分泌,从而抑制卵母细胞的体外成熟。本研究为阐明RFRP-3对哺乳动物卵母细胞的调控作用奠定理论基础。