沙门菌基因分型研究进展

沙门菌是一种常见的致病菌,种类繁多,具有2 600多种血清型。近年来,基于基因序列的分型方法被应用于沙门菌基因分型的研究中,并且显示了很好的分型能力,并成为沙门菌传染病暴发调查和分子流行病学分析中的常规工具。基因分型方法主要有:脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、基因组重复序列PCR(repetitive extragenic palindromic PCR,Rep-PCR)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、全基因组单核苷酸多态性分型(whole gene single nucleotide polymorphism,wgSNP)、核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)等,每种分型方法也有各自的优缺点和使用条件及适用范围。其中,随着全基因组测序(WGS)时代的到来,cgMLST和wgSNP方法已经成为当前研究热点。     

细菌全基因组测序技术用于沙门氏菌流行病学调查的可行性分析

为探讨细菌全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术在基层沙门氏菌防控中的优势与可行性，对前期分离的9株沙门氏菌进行细菌全基因组测序，并进行血清型预测、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和耐药基因分析，将全基因组测序结果与传统血清分型和耐药性分析结果进行对比。结果显示：基于全基因组测序数据的血清分型结果与传统血清分型结果符合率为100%，两种方法对9株沙门氏菌血清分型结果完全一致；两种方法分析出的β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药基因与耐药表型符合率为100%，即耐药菌株中均含有4大类抗菌药物的耐药基因；用全基因组测序检测到利福平、磺胺类和四环素3大类抗菌药物的7个耐药基因，表明9株沙门氏菌可能对这3大类抗菌药物耐药。结果表明：全基因组测序结果与传统实验室诊断结果完全一致，且具有快速、低成本、操作简单等优势，并且随着测序技术的发展，其检测成本和周期将进一步缩减，因此基于细菌全基因组测序开发沙门氏菌快速分型和耐药性分析方法有一定的应用价值和可行性。     

陕西省犊牛安氏隐孢子虫多位点序列分型研究

为了对陕西省犊牛安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),本研究基于4个基因位点对陕西省4个地区的36份犊牛(0~6月龄)C.andersoni阳性粪便样品进行PCR检测和序列分析。结果显示,15份C.andersoni分离株在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点均被成功分型,形成A4、A4、A2、A1,A4、A4、A4、A1,A5、A4、A4、A1和A1、A4、A4、A1共4个MLST亚型。其中A4、A4、A4、A1广泛分布于各个养殖场与不同品种犊牛中,为该地区犊牛C.andersoni的优势亚型。该研究结果表明,陕西地区犊牛C.andersoni存在遗传多样性,具有多种MLST亚型。     

全基因组重测序在畜禽研究领域的应用进展

全基因组重测序(whole genome resequencing, WGRS)是对已知参考基因组序列的物种进行不同个体间的全基因组水平的测序,具有检测变异类型丰富、高性价比、应用广泛等优点。随着测序成本的降低和畜禽基因组测序工作的完成,全基因组重测序技术已成为畜禽遗传变异研究的重要工具。全基因组重测序技术可获得大量基因变异信息,包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)、插入缺失(insertion/deletion, InDel)、结构变异(structural variation, SV)和拷贝数变异(copy number variation, CNV)等,丰富了现有的基因组序列,形成的大量数据集为探索畜禽表型性状和遗传改良提供了一个基因组信息库,以促进对畜禽遗传资源的深入研究与利用。作者概述了全基因组重测序技术及其关键影响因素(测序深度、序列比对和变异检测),重点综述了该技术在重要畜禽(牛、羊、猪、鸡)研究领域的应用进展,并对将来侧重于整合分析重测序数据、精准表型记录和多组学信息的研究趋势进行了展望。     

河南郑州地区奶牛源安氏隐孢子虫虫种鉴定及多位点序列分型研究

为了解河南省郑州地区奶牛隐孢子虫及安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,C.andersoni)的亚型分布情况,本研究共采集3个奶牛场共973份奶牛新鲜粪便样品,采用显微镜检测方法进行隐孢子虫检测,对形态学鉴定的8份C.andersoni阳性样品分别基于SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因位点进行虫种鉴定,基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16基因位点进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。结果显示,隐孢子虫总感染率为2.77%(27/973),而且以断奶前犊牛感染率最高7.10%(12/169)。8份样品在不同基因位点均成功鉴定为C.andersoni分离株,并形成4个MLST亚型,其中A4、A4、A4、A1为优势亚型,A6、A4、A2、A1为新亚型,且不同亚型的卵囊大小具有显著差异。研究表明,河南省郑州地区奶牛隐孢子虫总体感染水平较低,但是对奶牛养殖业和牛奶产量仍然有较大影响,此外,C.andersoni存在多个MLST亚型,表明具有遗传多样性。     

甘肃部分地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的细菌多位点序列分型与毒力检测

为研究甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐药情况、基因型总体结构特征及毒力因子的分布情况,从甘肃省东、中和西部3个地区的3个县市采集41头罹患临床型乳房炎奶牛的93份乳样,采用鉴别培养基分离纯化细菌。采用K-B法对分离株进行耐药性分析,常规PCR方法检测mecA抗性基因和14种常见毒力基因以及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。结果显示,93份乳样中分离出28株金黄色葡萄球菌;分离株有不同程度的耐药且多为多重耐药(16株),多重耐药菌株占57.14%,未发现耐万古霉素菌株(VRSA),万古霉素敏感率为100%;28株分离菌中共检出mecA阳性11株,检出率为39.3%;共获得9个已知ST型;有12种毒力基因不同程度被检出,其中nuc、spa和coa检出率为100%,hlb、set1、clfA、FnBPA和seb阳性检出率均大于50%,sak、seg、PVL和sea的检出率依次为28.6%、7.9%、14.3%和21.4%,而FnBPB、hla基因未检出。研究结果可为甘肃省牛源金黄色葡萄球菌的耐药性评价、溯源分析和治疗提供参考依据。     

简化基因组测序在畜禽应用中的研究进展

简化基因组测序(reduced-representation genome sequencing, RRGS)是指利用生物信息学方法设计标记开发方案,富集特异性长度片段,应用高通量测序技术获得海量标签序列来代表目标物种全基因组信息的测序方法。通过RRGS能够发现更多新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,为研究控制畜禽生长发育、肉质调控、代谢调节基因及其遗传进化多样性提供重要基础分析数据。文章主要对RRGS中的限制性酶切位点相关DNA测序(restriction-site associated DNA,RAD-seq)、2b-RAD(ⅡB restriction-site associated DNA)、双酶切简化基因组测序(double digest RAD,ddRAD-seq)和基因分型测序(genotyping by sequencing, GBS)四种技术原理及在畜禽分子标记开发、遗传图谱构建和数量性状定位(QTL)方面的应用进行综述,旨在为简化基因组测序在畜禽育种研究中的应用提供基础资料。     

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应指纹图谱技术用于细菌分型的研究进展

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)指纹图谱技术利用普遍存在于生物体内的ERIC进行引物设计,通过基因扩增,获得能够表征其基因组结构的产物,该方法简单易行、重复性好、用时短,被广泛应用于细菌基因分型及同源性判别。本文简述细菌分型的研究背景和ERIC-PCR指纹图谱技术的原理及特点,归纳该技术在细菌基因分型方面的优缺点及其在常见食源性致病菌基因分型中的应用现状,并对ERIC-PCR指纹图谱技术应用于乳品企业污染菌溯源的研究进行展望。     

乳房链球菌多位点序列分型和遗传进化特征分析

为探究中国不同地区来源的乳房链球菌（Streptococcus uberis，S.uberis）之间的多样性和遗传进化关系，本研究以部分地区分离到的38株乳房链球菌为研究对象，通过对其最小抑菌浓度（minimun inhibitory concentration，MIC）测定和全基因组框架测序，获取38株菌耐药性、耐药基因及毒力基因等相关信息；通过多位点序列分型技术（multilocus sequence typing，MLST）分析了7个管家基因的等位基因谱、序列型（sequence type，ST）和克隆复合体（clonal complexes，CCs），并构建系统进化树。MIC试验共采用15种抗生素，除头孢噻呋和氟苯尼考外，38株乳房链球菌对其中13种抗生素具有不同程度耐药，且江苏地区的耐药性明显强于新疆地区；耐药和毒力基因比对后发现，仅24株菌携带耐药基因，剩余14株则不携带耐药基因且属新疆地区分离株，与MIC试验结果相符；15种毒力基因中，除cfu、hasA/B和lbp外，余下12种毒力基因的携带率均高达100%。MLST结果表明，38株乳房链球菌共属于17个ST型，其中有15个ST型从未报道，仅supan01 1株菌属于ST-5 CCs。进化树结果揭示，38株分离株之间的亲缘性较远，分布呈地区依赖性，且中国部分地区当前流行的乳房链球菌与西方国家流行的菌株差异较大。本研究丰富了乳房链球菌的MLST分型数据库，为了解中国乳房链球菌遗传特性和分布特点提供了参考依据。     

鸡滑液支原体的分离鉴定与多位点序列分型

为明确国内鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）的流行情况,本研究在2016~2021年间,从山东、四川、河北等10省份共计分离到54株MS,通过多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）方法对分离株进行基因分型,同时结合国内外的分离株信息,进一步分析了不同菌株间的进化关系。结果表明,54株MS分离株可分为9种ST型,分别是34、44、93、95、96、102、103、148、153,主要流行的ST型为ST34和ST93;按照进化关系可分为A-I 共9类,其中最主要的流行株为A类和E类。通过对国内外MS流行株进行遗传进化分析,可依据地域将其分为亚洲株、欧洲株、北美株和其他株,其中,中国分离株有独特的地域进化关系。本研究结果丰富了国内的MS流行病学数据,对防控与净化MS具有重要意义。     

新疆维吾尔自治区阿克苏地区某屠宰场羊源大肠杆菌MLST分型、耐药性分析和毒力基因检测

[目的]了解新疆维吾尔自治区阿克苏地区屠宰场羊源大肠杆菌的流行情况以及耐药性和毒力基因分布特征。[方法]从阿克苏地区某屠宰场采集健康羊的淋巴结、胴体拭子、粪便样本共30份,使用选择性培养基分离大肠杆菌,然后采用大肠杆菌特异性phoA基因对其进行分子生物学鉴定;利用PCR扩增及测序技术对大肠杆菌分离株进行多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）;采用K-B纸片扩散法开展分离菌株对抗菌药物的敏感性试验;应用PCR技术检测分离菌株的耐药基因和毒力基因携带情况;使用96孔板微量肉汤法测定分离菌株的生物被膜形成能力。[结果]从30份样本中分离得到14株大肠杆菌,分离率为46.67%;14株分离株分属于10个MLST型别;对复方新诺明（100%）、青霉素（85.71%）和四环素（50.00%）耐药率较高,9株菌具有多重耐药表型（64.29%）;在14株大肠杆菌中检测到blaTEM(85.71%)、aph(3′)（71.43%）、tetA(64.29%)、sul1(57.14%)和sul2(57.14%)等12种耐药基因,并且8株菌携带Ⅰ型整合子int-Ⅰ基因...     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia, PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒...     

2株温和气单胞菌SNP位点比较分析

通过Illumina HiSeq 2500测序仪对2株温和气单胞菌A1、B2进行全基因组重测序,并与参考基因组(Aeromonas veronii B565,complete genome)序列进行比较,A1、B2与参考基因组之间共获得约100 018个SNP位点,与参考基因组平均比对率为74.46%。根据编码区SNPs分布与参考基因组间进行检测;通过COG和GO的功能注释,寻找A1、B2Diff基因的SNPs位点对2株温和气单胞菌进行注释分析,了解温和气单胞菌致病机制与基因组成,为今后温和气单胞菌的研究提供科学数据。     

家兔肠炎沙门氏菌病流行病学调查及防控

2017年2月,山东省某兔场出现以母兔流产、死亡,仔兔脾脏肿大、死亡为主要临床特征的传染病。初步诊断为沙门氏菌病,实验室确诊为肠炎沙门氏菌感染。针对此疫情,我们筛选出一套快速、准确的兔肠炎沙门氏菌检测法。利用此方法对该兔场的两个兔舍、分兔场和周边兔场样品进行肠炎沙门氏菌检测,并对不同兔场肠炎沙门氏菌分离株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)鉴定和药敏试验。最后进行了自家灭活苗的一次免疫和两次免疫免疫效果的比较试验。结果显示:不同兔场的粪便沙门氏菌检出率为30.30%～73.33%;各场分离菌株为同一序列型,都是ST.11;不同兔场分离菌株的耐药谱明显不同,最多可耐8种药物,最少的也耐2种药物,对头孢噻肟、丁胺卡那和氟苯尼考的敏感性最高;自家苗不同次数免疫均起到了良好的保护作用,但两次免疫效果优于一次免疫。本研究为家兔沙门氏菌病的流行病学调查和防控提供了经验和参考数据。     

一种副猪嗜血杆菌新型分型方法——多基因位点序列分型

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)为革兰氏阴性菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是猪副猪嗜血杆菌病的主要致病菌.应用多基因位点序列分型技术对副猪嗜血杆菌进行分型,具有简便快速、重复性强、分辨率较高、所得数据标准等优点.并且还可通过互联网实现实验室间数据共享及比较.通过试验对多基因位点序列分型(MLST)技术的原理、方法及结果进行了阐述.以期为副猪嗜血杆菌的分型提供参考.     

家蚕滞育生物钟蛋白质EA4基因的cDNA克隆和序列分析

家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4(EA4)的倒计时型生物钟。EA4是具时间间隔测定酶(time interval measuring enzyme,TIME)功能的蛋白质。根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以第3天龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT-PCR方法,得到308 bp的部分ea4序列,其1-144 nt和145-308 nt分别与家蚕全基因组鸟枪序列(whole genome shotgun sequence,WGS)AADK01019126.1的5595-5738 nt及WGS AADK01014467.1的8636-8473 nt有95%和98%的一致性。根据获得的ea4基因片段序列,利用生物信息学方法和家蚕基因组数据预测了ea4基因的完整cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,进行RT-PCR得到完整的cDNA。ea4基因的cDNA全长519 bp,其中1-48 bp为信号肽序列,49-519 bp编码的氨基酸与蛋白质纯化后测序EA4部分的一致性为98%,C末端存在3个氨基酸的差异,其中第156位为新确定氨基酸。     

多位点序列分型技术在凝结芽孢杆菌菌株分类中的应用

本文通过16S rRNA基因和多位点序列分型(MLST)技术,对凝结芽孢杆菌不同菌株进行亲缘关系分析.试验选取国内具有代表性的15株凝结芽孢杆菌菌株,菌株纯化后提取基因组DNA,采用传统的16S rRNA基因分子鉴定和MLST技术相结合进行分析.其中MLST采用5个管家基因:adk、recF、sucC、rpoB和spo...     

多杀性巴氏杆菌分型方法研究进展

多杀性巴氏杆菌是一种人兽共患病病原菌,可引起多种动物及人类疾病。目前临床上对多杀性巴氏杆菌的分型多采用基于免疫试验为基础的血清学分型和基于基因特征为依据的分子分型。血清学方法操作繁琐,对抗血清的特异性有很高的要求,不适宜临床大规模快速进行流行病学调查。分子分型具有分辨力高和重复性好等优点,因而在临床中得到了广泛应用。分子分型方法主要包括荚膜多重PCR分型、脂多糖多重PCR分型、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳、全基因组序列分析等。论文就每种分型方法的原理、优缺点和适用范围进行介绍,以期为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查,特别是分子流行病学调查提供参考。     

牛胚胎基因组选择研究进展

牛胚胎基因组选择(embryonic genome selection, EGS)是指活检牛早期胚胎中部分滋养层细胞,通过微量胚胎细胞全基因组扩增,进行遗传育种值评估,筛选出优质早期胚胎。该项技术的基本步骤是：对第6天左右的早期牛囊胚进行活检取样,利用显微切割系统切取微量滋养层细胞,随后通过微量细胞全基因组扩增(whole genomic amplification),经单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism)分析后,对早期胚胎进行生产性能预测,从而筛选出基因型优良的胚胎进行移植。本文总结了EGS技术中常用的活检方法、扩增方法,并概述了该技术在牛上的应用现状与该项技术当前存在的一些问题,以期为未来EGS技术的全面发展提供参考。     

高密度SNP芯片及其对肉牛育种影响的研究进展

近年来先进的测序和基因分型技术促进了肉牛育种方法的革新。从过去低通量、耗时的限制性片段多态标记(RFLP)到如今高通量、高密度的单核苷酸多态性(SNP)标记,基因检测效率大幅提高。随着肉牛基因组序列图谱及SNP图谱的完成,基于高密度SNP标记的牛全基因组选择成了牛育种的新热点。作者立足高密度SNP芯片对肉牛育种的影响,综述高密度SNP芯片及和下一代测定技术及肉牛全基因组选择的研究进展,阐明高密度SNP芯片对多品种全基因组选择的模型的建立及准确的预测基因组育种值极其重要。