非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速简便、灵敏度高、准确性好的非洲猪瘟病毒恒温快速检测方法,根据ASFV P72基因保守区域设计特异性引物,优化引物浓度、反应温度、反应时间,建立了一种基于SYTO9荧光染料的非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP快速检测方法。结果表明,该方法在63℃条件下扩增40 min,该方法灵敏度高,最低可检测限为10 copies/μL;特异性良好,与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应;重复性好,变异系数低于5%。对70份临床样本检测,4份血液样品和9份脾脏样品检测阳性,与荧光定量PCR检测结果符合率为100%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好、符合率高,适用于非洲猪瘟现场快速诊断。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10~2 copies,同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。     

猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种针对猪瘟病毒的,快速、灵敏、特异的两步法检测技术。该方法的检测灵敏度与反转录巢式PCR(RT-NestPCR)相当,最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。该方法的建立为猪瘟病毒的快速诊断提供了新思路。     

非洲马瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立非洲马瘟病毒(AHSV)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,基于AHSV VP7基因保守序列,设计2对特异性扩增引物。通过对反应体系中各组分浓度,反应温度及时间的优化,建立了快速、灵敏的AHSV RT-LAMP检测方法,并对该方法特异性、灵敏度、重复性进行探索。结果表明,在63℃恒温下反应45min,便可进行高效率的特异性扩增。反应产物经琼脂糖凝胶电泳和染料可视化鉴定,能够快速有效检测AHSV。用建立的方法检测马属动物易感的4种疫病病原,结果均为阴性,证实具有较高的特异性。灵敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP检测方法,具有快速、特异、灵敏、操作简单、设备要求低的特点,适合用于现场AHSV快速检测。     

猪流感病毒LAMP检测方法的建立

本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。     

非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)通用型高通量检测技术,利用高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因,制备质粒标准品,建立实时荧光LAMP方法,出现典型的S形核酸扩增曲线,扩增产物具有特异的熔解曲线。G1211R基因质粒标准品在1.81×10~5拷贝数/μL~1.81×10~9拷贝数/μL对数值与Ct值之间的线性关系良好。以ASFV E70株病毒核酸为模板,LAMP检测灵敏度达到21pg,优于荧光定量PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP方法检测ASFV特异性良好,与猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸无交叉反应。以ASFV Arm 07株制备各种临床模拟样品,检出阳性率达到17.31%。检测方法的建立,可为非洲猪瘟防控提供新的技术手段,有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立猪瘟病毒(CSFV)可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法,从GenBank下载不同基因亚型CSFV分离株全基因序列,通过引物设计, RT-LAMP反应体系优化,建立了检测CSFV的RT-LAMP方法。该方法特异性和敏感性好,对CSFV cDNA最低检测限量为1.0×10~(-7) ng/μL,不能检测到非目标病毒核酸。对临床送检的100份疑似CSFV感染样品进行检测,检出13份CSFV阳性,其中10份和RT-PCR检测结果一致,另外3份的RT-PCR检测结果呈阴性,同时对比发现RT-LAMP方法的敏感性比常规RT-PCR方法高100倍。本研究为CSFV检测提供了可供选择的方法。     

猪伪狂犬病病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据Gen Bank中猪伪狂犬病病毒(PRV)g B基因的保守序列,设计一套特异性引物,在对反应条件进行优化后,建立了PRV环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法。结果显示:该方法能在常规65℃水浴锅中30 min内实现对目的片段的特异性扩增,并且可通过肉眼观察颜色直接判定检测结果 ;该方法具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;该方法的敏感性可达1 fg;将该方法应用于临床样品检测,结果与普通PCR方法一致。研究表明,本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合基层PRV感染的快速检测。     

环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒

以人工合成的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72全长基因为模板,利用在线软件Primer Explorer4设计环介导恒温扩增(LAMP)的内、外引物,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了ASFV的LAMP检测方法,同时进行了敏感性和特异性试验。结果表明,所建立的LAMP检测方法最低检测限可达10拷贝质粒DNA,且具有良好的特异性,LAMP产物的酶切鉴定也验证了反应的特异性。对凝胶电泳后紫外观察、肉眼观察颜色变化、生成沉淀观察以及实时荧光PCR扩增曲线Ct值判定等不同判定方法进行比较表明,以上结果判定方法各有其优缺点,其中荧光PCR的敏感性最高,染色法相对较方便直观,电泳法敏感性稍低。     

柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立

本文根据GenBank中柑橘黄龙病菌的外膜蛋白（omp）基因序列,设计了1套环介导等温扩增引物,建立了柑橘黄龙病的环介导等温扩增检测方法。该方法敏感度可达25pg/μL,与实时荧光PCR方法灵敏度相同。全部反应只需一个可控温的水浴锅在60min内即可完成,通过肉眼观察颜色即可直接判定结果。本研究建立的环介导等温扩增方法简便、快速、灵敏、特异,适用于基层工作站的柑橘黄龙病鉴定工作。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立

应用通用反转录试剂盒和环介导等温核酸扩增技术(LAMP)建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,同时评价了该检测方法的特异性、稳定性和灵敏度。结果表明,根据猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因保守区设计的LAMP引物能够在64.5℃60min内实现对目标核酸片段的大量扩增,检测结果可通过直接观察反应副产物(焦磷酸镁)进行判读,该检测系统具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒等均无交叉反应;通过PRRSV不同毒株疫苗、模拟样品和临床样品确定,该检测系统具有很好的稳定性;通过质粒确定该检测系统可以检测到10拷贝/μL的病毒核酸模板。结果表明成功建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用

为实现鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。     

弓形虫LAMP荧光检测方法的建立与应用

为建立一种弓形虫环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法,以弓形虫高度重复性保守序列为模板,设计合成2组引物,对引物组进行比对和反应条件优化,确定特异性与灵敏度。结果表明,建立的方法在62℃50 min内对弓形虫的检测灵敏度为1 copies/μL,灵敏度高于行业标准(NY/T 573—2022),且优于市售的实时荧光定量PCR检测试剂盒,与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体均无交叉反应。应用LAMP荧光方法检测已知背景信息的200份弓形虫临床样品,检出阳性样品10份,阴性样品190份,检测结果与标准方法、荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP方法具有快速、灵敏度高、特异性强、仪器设备适用范围广等优点,适于在兽医实验室及动物医院推广应用。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。