犬瘟热病毒的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定犬瘟热病毒(CDV)的石河子流行株。[方法]对临床症状疑似犬瘟热和血清学(ELISA)检测为阳性的自然发病犬,取其淋巴结为病料,接种于非洲绿猴肾细胞系(Vero),进行病毒的分离;用RT-PCR检测感染CDV分离株特异性核酸。[结果]病料接种Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),用RT-PCR技术可扩增出CDV特异性核酸,扩增出的基因片段与预期设计的长度相同,所扩增的CDV分离株H基因片段与CDV C54标准强毒株核苷酸同源性为98.4%。[结论]该研究成功分离并鉴定了CDV石河子流行株,为犬瘟热(CD)的确诊提供了依据。     

犬瘟热病毒CDV-PS株致病力及基因进化分析

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起急性、热性、高度接触性传染病,貂、狐、貉、犬、熊猫、虎等动物易感。本试验研究了犬瘟热CDVPS株对犬的致病力。结果发现,试验犬于病毒接种后的19 d死亡;脏器剖检肺部有出血斑,肝脏肿大,肠系膜充血,膀胱壁变厚;组织切片脾脏淋巴细胞浸润,肺气肿,脑组织神经细胞自噬现象;构建犬瘟热病毒H基因遗传发育树,CDV-PS株分类于Asia-1型分支,与目前我国主要的犬瘟热病毒流行株类型一致。本研究对犬瘟热病毒CDV-PS株感染犬的临床症状、脏器剖检、组织病理变化以及病毒体内分布和H基因特征进行了详细研究,为更好地预防和控制犬瘟热提供基础。     

犬瘟热病毒的分离

对流行病学调查、临床症状检查和血清学（ELISA）检测为阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法分别接种于非洲绿猴肾细胞系（Vero）、犬肾细胞系（MDCK）进行病毒的分离.用多聚酶链式反应（RT-PCR）检测感染细胞中的病毒核酸.结果表明,病料接种Vero细胞、MDCK细胞均产生明显的细胞病变（CPE）;用RT-PCR 技术检测病毒感染的细胞培养液,扩增出特异性的产物带,扩增出的片段大小分子长为760bp,与预期设计的长度相同.用Vero细胞同步培养从肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ1株;用MDCK细胞同步培养从另一只犬的肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ2株.     

犬瘟热的诊断与治疗

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种犬高度接触性、致死性的传染病。不同年龄、性别和品种的犬都可能感染该病,主要以幼龄犬容易染病。结合对2例犬瘟热疾病的诊断和治疗,总结了犬瘟热的传播方式和发病机理、临床症状及当前的防治策略,以期为该病的诊断与防治提供参考。     

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒(CDV)。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%~99.7%、98.3%~99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%~99.5%、97.0%~98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%~99.2%、98.7%~99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株(Onderstepoort和Snyder Hill)的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%~94.0%、96.8%~98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。     

CPV-2c型犬细小病毒分离及其VP2序列分析

采用犬细小病毒PCR诊断方法对临床的犬细小病毒病料进行检测,通过序列鉴定确定为1株CPV-2c型犬细小病毒(命名为2c-I),与近年来国内分离株的核苷酸同源性为99.3%～99.9%,与国外分离株的核苷酸同源性为98.5%～99.8%。此外,CPV 2c-I分离株在267、324、377、440位点氨基酸发生了变异。通过构建进化树发现,2c-I隶属我国目前流行CPV-2c的分支,但与国内最近3年内分离CPV-2c存在一定的遗传变异。     

2019—2020 年河南与河北部分地区犬瘟热流行病学调查及病毒分离鉴定

【目的】了解近年来犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus,CDV）在我国中部地区的流行及遗传变异情况。【方法】于 2019—2020 年期间从河南和河北两省部分地区随机采集犬、水貂、貉和狐狸样品 459 份,进行 RT-PCR 检测、毒株分离鉴定、病毒血凝素（Hemagglutinin,H）基因测序和遗传进化分析。【结果】检出 CDV 阳性样品 87 份,阳性率为 18.96%。犬在秋季的 CDV 阳性率较高,为 37.77%;水貂、貉和狐狸则多于夏季 7 月患病;不同年龄的动物均可发病,幼龄动物更为易感。从病犬样本中成功分离到 1 株 CDV,经鉴定后命名为 HB19-1 株。基于 H 基因序列的遗传进化分析表明,HB19-1 株属于亚洲 1 型毒株,与 GenBank 中的KJ994343 毒株同源性最高,与疫苗株Onderstepoort（GenBank 登录号：AF378705）的核苷酸和氨基酸同源性分别为 91.3% 和 90.2%。【结论】在河南和河北部分地区犬及毛皮动物的 CDV 流行病学调查过程中成功分离到 1株犬源毒株 HB19-1,遗传进化分析显示该毒株为亚洲 1 型,且与疫苗株同源性较低。研究结果可为流调所涉地区的 CDV 预防、疫苗选择与使用提供依据。     

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。     

犬瘟热疫苗株CDV3核蛋白基因全序列测序及分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白(N)蛋白基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,提取犬瘟热病毒疫苗株CDV3的RNA为模板,采用RT-PCR扩增病毒的N蛋白基因,并进行产物克隆和序列分析。将CDV3疫苗株N基因与GenBank数据库中的疫苗株Onderstepoort及中国、美国和德国等分离的疫苗株或毒株共14株CDV N基因序列进行同源性分析,发现CDV3 N基因序列与疫苗株Onderstepoort的同源性为97.1%,与其他分离毒株的核苷酸同源性为92.8%～94.0%,其中与中国分离的TN株同源性为93.6%;然而,CDV3 N蛋白与它们的氨基酸同源性却基本都为96.6%～97.3%。这说明虽然犬瘟热弱毒株CDV3在核苷酸水平上与其他疫苗株毒株的差异较大,但是在氨基酸水平上的比较差异较小。     

犬瘟热病的防治

<正>犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病。其特征是双相热型、白细胞减少、急性鼻炎、支气管肺炎、胃肠炎、神经机能紊乱等。该病全国各地均有发生,尤其幼犬发病较多,青年犬也会感染发病。一、病源犬瘟热病毒属RNA病毒,对乙醚和氯仿敏感,这种病毒可以在犬肾单层细胞培养中生长繁殖,并形成核内胞浆内包涵体及星状细胞。日光照射14小时能将这种病毒     

猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ07A株的分离及其结构蛋白基因的序列分析

从福建某猪场发生疑似"高热病"死亡的小猪病料中分离到1株病毒,该病毒在Marc-145细胞上增殖致细胞病变。对分离病毒的TCID50、动物回归试验、RT-PCR鉴定及对病毒株的结构蛋白基因进行了测定与分析。结果表明:分离毒株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(命名为PRRSV-FJ07A),TCID50为10-6.5.mL-1,对35日仔猪具有致病性,结构蛋白基因与美洲型代表株VR-2332核苷酸同源性为89.2%～95.8%,氨基酸同源性为88.1%～96.2%;与国内PRRSV-HUN4株的核苷酸同源性为90.1%～99.7%,氨基酸同源性为88.3%～100.0%;与欧洲代表株LV的核苷酸同源性为63.7%～70.0%,氨基酸同源性为59.6%～78.9%。PRRSV-FJ07A序列已登陆Genbank,登录号为GI:283100314。     

犬瘟热病毒感染的诊断方法比较

采用犬瘟热病毒抗原快速检测试纸和RT-PCR方法,对2008～2009年在兰州市和乌鲁木齐市的50份疑似犬瘟热患病犬样品进行检测对比,结果发现这2种方法的符合率达96%。犬瘟热病毒抗原快速检测试纸是一种比较可靠的临床检测犬瘟热病毒感染的方法,而敏感性和特异性很高的RT-PCR方法更适合研究领域。     

本地土犬犬瘟热的防治分析

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病,传染性极强,死亡率可高达80％以上.临诊实践中,接种疫苗是最好的防治方法,对患病犬只的治疗原则是抗病毒、防治继发感染、对症治疗和支持治疗法,但治疗效果与患犬自身的抗病能力及病程密切相关.抗病能力稍好的患犬较易治愈;发病初期的较中、后期较易治愈.     

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础.[方法]采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPT)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析.[结果]从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽Ⅰ型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60 h,ICPI为1.45;分离株F基因112~117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%.[结论]猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势.     

犬瘟热病毒融合蛋白融合区基因的序列分析

以分离的犬瘟热病毒（CDV）株感染Vero细胞后提取病毒RNA，经反转录后，用犬瘟热病毒的1对引物扩增出融合蛋白融合区的基因片断。经序列分析显示：分离株CDV－YZ－0101与CDV－YZ－0103在核苷酸和氨基酸水平上同源性一致，与CDV－YZ－0102、CDV－A75／17、CDV－ONPPDV2、PDV1在核苷酸和氮基酸水平上的同源性分别为99.6%、97.9%、92.9％、98.9%、76.2%、93.3%和98.9%、97.9%、98.9%、83.0%、97.9%，表明分离株和相关毒株的融合区基因存在差别。     

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS5b基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。     

关于犬瘟热临床治疗的体会

犬瘟热是一种四季都有可能发生的,对犬危害严重的传染病。犬瘟热的临床症状是食欲废绝,嘴角流涎,眼、鼻分泌物增多,咳嗽。一般伴随呕吐或腹泻,患病犬口舌疼痛,虽饥饿欲进食却不能下咽,饮水困难。后期患病犬会发生神经症状,严重的还有抽搐和痉挛发作的症状,犬瘟热病毒还会侵害脚部和鼻部的皮肤,致使此部位的皮肤角质化,此病毒还会侵害患病犬的脑组织,一旦脑组织被侵害则很难恢复。犬瘟热是全球性疾病,是未接受过免疫的犬的最主要的和导致死亡率最高的疾病。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株的分离鉴定及序列分析

【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒(JEV),确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM(456~695位)区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变(CPE);用该病毒接种3日龄乳鼠,72 h之内即可导致乳鼠死亡;SXBJ07株PrM(456~695位)区基因分型证实,分离株属于基因Ⅰ型,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的同源性分别为87.7%和97.0%,但在E蛋白的活性关键结构域有13个氨基酸存在差异。【结论】从陕西省境内首次成功分离到1株Ⅰ型乙脑病毒,初步确定了该分离株的分子特征,对乙型脑炎的流行病学研究及其防治具有重要意义。     

从芦花鸡分离的J亚群ALV病毒及其gp85基因演化

采用RT-PCR方法直接从芦花鸡肿瘤中进行禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)的核酸扩增,经测序证实为ALV。将上述病料接种DF1细胞(C/E)进行盲传,并对其感染细胞上清进行ALV P27抗原检测,结果为阳性,证实获得了一株病毒,命名为SDJN2012。用PCR方法扩增其囊膜蛋白gp85基因并测序,与GenBank中的ALV参考毒株进行核苷酸或氨基酸同源性比较。结果表明:SDJN2012与山东较早发现的J亚群ALV代表株SD0001的核苷酸(氨基酸)同源性最高,达93.4%(92.6%),与J亚群不同年代的代表株同源性为88.6%~93.3%(88.2%~90.6%),而与A,C,D,E亚群ALV毒株的同源性仅为19.7%~32.2%(10.2%~32.2%),进一步确证分离到的病毒为J亚群ALV。对种蛋的跟踪监测证实:ALV蛋清P27抗原阳性率为37.6%,而血清学监测则呈现多样性的变化:鸡群发病前J亚群ALV抗体检测为阴性,发病后阳性率仅为9.35%,而A/B亚群阳性率则由发病前的9.8%,攀升到发病后的75.4%,彰显出ALV病原学、血清学和分子流行病学的复杂性。     

一例犬瘟热病诊治与体会

<正>犬瘟热病犬以呈现双相热型、鼻炎、严重的消化道障碍和呼吸道炎症等为特征。根据个体情况与治疗条件的不同,该病的病死率差异很大,一般在30~80%之间,患病动物在康复后还易留有麻痹、抽搐等后遗症,是损害养犬业最严重的疫病之一。其病原体是犬瘟热病毒,具有较强的抵抗力,在干燥环境下能存活1年。本文结合一例犬瘟热病例对诊治情况介绍如下。