欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

兰州大尾羊肾和睾丸组织细胞的分离培养和鉴定

兰州大尾羊是中国濒临灭绝的物种，通过体细胞培养和长期保存，在细胞水平上保存珍贵的种质资源。采用胰蛋白酶消化分离并培养原代肾细胞和睾丸细胞，并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存，细胞复苏后进行活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查，保存兰州大尾羊26个个体的肾细胞和9个个体睾丸细胞，保存细胞生长良好，均呈成纤维型，平均复苏活力为98.6%和95.2%，生长曲线均呈“S”型，最大增殖密度分别为3.15×10⁵ mL^-1 和2.92×10⁵ mL^-1，倍增时间分别为29.3 h和30.8 h，细菌、真菌、病毒和支原体检查均为阴性，染色体为2n=54，二倍体占88%和90%，说明成功分离培养并保存兰州大尾羊肾和睾丸组织细胞。     

兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立

通过物种体细胞培养和长期保存,可在细胞水平上保存珍贵的种质资源.采用组织块培养法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查.结果表明:保存了兰州大尾羊27个个体的耳缘细胞,保存的细胞平均复苏活力97.6％,生长良好,形态呈成纤维型,生长曲线呈“S”型,最大增殖浓度3.01×105个·mL-1,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2 n=54,二倍体占88％.最终,成功培养并保存了兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞,使这一珍贵的种质资源在细胞水平上得以长期保存.     

河曲马睾丸组织成纤维细胞系的建立及生物学特性研究

采集河曲马睾丸组织,用热消化法制备原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型、乳酸脱氢同工酶谱及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果显示,河曲马睾丸组织原代和传代细胞呈成纤维型,生长良好,最大增殖数量为4.32×105 mL-1,倍增时间为34.58h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性;染色体2 N=64,二倍体为85%,占主体;乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱有明显特征,共有4条谱带,其中LDH3浓度较高,活性较强;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。表明已成功建立河曲马睾丸组织成纤维细胞系,使河曲马这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

豚鼠胎儿成纤维细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立豚鼠成纤维细胞系，分离培养豚鼠胎儿成纤维细胞，并对其进行细胞活力、生长曲线、细胞周期及基因转染等分析。结果表明，豚鼠胎儿成纤维细胞在10代以内时形态良好，随着传代次数的增加，梭型细胞有拉长趋势，至第20代时梭形明显拉长，单位面积细胞数目大量减少。同时，细胞冻存后复苏贴壁情况良好。EGFP基因转染的成纤维细胞形态特征及生长状态与未转染细胞相似，转基因细胞和未转基因细胞的生长曲线均为S形，符合体外培养细胞正常生长增殖规律。以流式细胞仪分析逆转录病毒介导的EGFP基因转染细胞，可见染色体核型仍为二倍体，说明感染的细胞保持其遗传稳定性。流式细胞仪检测转染后不同时间点收集的病毒液感染的细胞效率，结果显示，病毒转染48 h、72 h收集病毒液组感染效率分别为16.9%和11.6%，显著高于24 h收集病毒液组(0.9%)。     

版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征

以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

奶山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

试验分别采用组织块贴壁法和消化分离法对奶山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功建立了奶山羊胎儿成纤维细胞系,并对该细胞系进行了形态学观察、生长动力学分析、细胞活力测定、核型分析和微生物检测等多种生物学特性分析.结果表明:成纤维细胞原代培养采用贴块培养时所需时间较长,消化培养有较多死细胞;传代细胞生长情况良好,群体倍增时间(PDT)约为40.4h;生长总体趋势呈"S"型;冻存后活力为92.3%,生长状况与冻存前一致;细胞染色体中二倍体(2 n=60)占主体;细菌、真菌和支原体检测结果均为阴性,细胞系的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准.     

藏羊源屎肠球菌的分离、鉴定及体外益生特性

为了获得藏羊源益生菌，利用形态学、生化试验和分子生物学方法对屎肠球菌进行分离与鉴定，通过抑菌试验、耐受性试验、生长曲线与产酸能力试验以及药敏试验对屎肠球菌分离菌株的体外益生特性进行评价。结果显示，藏羊源屎肠球菌分离菌株EF1-mh在Pfizer肠球菌选择性琼脂上呈棕黑色菌落，胆汁七叶苷培养呈黑色等生理生化结果符合肠球菌特征，分离株16S rDNA序列分别与参考屎肠球菌序列相似性均达99%以上，PCR成功扩增出种特异性基因ddl和adk基因，明确分离菌株EF1-mh是屎肠球菌。分离株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌分离株的抑菌圈直径均在8.64 mm以上；分离菌株具有一定耐受性，于60 ~ 80 ℃水浴30 min培养16 h后，活菌浓度基本恢复。 在pH 2.0培养16 h活菌浓度为3.4×10² CFU·mL^-1；在pH 3.0培养4 h，活菌浓度为9.5×10⁶ CFU·mL^-1；在0.3%胆盐的 MRS 培养液中培养8 h活菌浓度为1.37×10³ CFU·mL^-1，在1%和2%胆盐的培养液中培养16 h仍有存活；生长速度快，4 h后进入了对数期，且培养10 h后菌液pH在4.3左右，产酸能力强，对氨苄西林、克林霉素等抗生素表现敏感，对多粘菌素B、头孢氨苄等抗生素表现为耐药。研究表明藏羊源屎肠球菌分离菌株EF1-mh具有较好的体外益生特性，这将有利于为藏羊源屎肠球菌的研究。     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交     

视网膜色素上皮细胞光损伤模型的建立与评估

目的 通过不同光照时间和光照强度,探索建立最佳视网膜色素上皮细胞光损伤模型,为视网膜光损伤细胞造模方法提供理论依据。方法 选取原代大鼠视网膜色素上皮细胞和大鼠视网膜色素上皮细胞系,LED白色冷光灯模拟自然光源,选取（2 500、5 000、7 500、10 000 Lux）作为光照强度,以不同光照时间（6、12 h） 对细胞进行照射,建立光损伤模型,镜下观察细胞形态,采用MTT法检测细胞活力。结果 光照处理后,RPE细胞活力受到抑制,随着光照强度及时间增强,细胞活力降低明显,原代细胞6 h 7 500、10 000 Lux和12 h 5 000、7 500、10 000 Lux,细胞系6 h 10 000 Lux和12 h 7 500、10 000 Lux,视网膜色素上皮细胞活力均低于空白组（P<0.01）,差异有统计学意义。结论 RPE细胞活力受光照时间及强度抑制,原代细胞较细胞系对光损伤更敏感。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存与体外培养研究

利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外培养40h左右死亡。     

Cell Ultrastructure of Kiwifruit （Actinidia chinensis） Shoot Tips During Cryopreservation

The changes in the cell ultrastructure of in vitro cultured shoot tips from dwarf genotype of kiwifruit （Actinidia chinensis Ganmi 5） during cryopreservation were investigated. Shoot tips were preserved in liquid nitrogen using vitrification, and the cell ultrastructure was examined using transmission electron microscopy （TEM）. The regular ultrastructure of the cell wall, cell membrane and nucleus of shoot tips could be damaged during the freezing and thawing associated with preservation using liquid nitrogen. The cell plasmolysis was increased and freezing tolerance was improved after precultufing and dehydrating in a preservation and vitrification solution （PVS2） （30% glycerol （Gly）＋ 15% ethylene glycol （EG）＋ 15% dimethylsulfoxide （DMSO） ＋ 0.4 mol L^-1 sucrose）. The structure of some cells with low degree of injury and reversible damage was similar to that of the control and they could undergo normal cell division and differentiation. Besides, they could recover automatically and regenerate after their reculture.     

Effect of MSTN Propeptide and shRNA Co-expression Vector on Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

Myostatin(MSTN)is a negative regulator of skeletal muscle growth,in order to study the effect of inhibition MSTN expression on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,we constructed co-expression vector pcDNA3.1-ProMSTNshRNA,transfected it into muscle satellite cells by Liposome 2000,and detected cell proliferation changes by CCK-8 method and flow cytometry after 48 h.The expressions of P21 and CDK2 were detected by Western blot and real-time PCR.The results showed that the cell vitality of experimental groups significantly increased than that of the negative control,and cells in S phase also increased significantly(P<0.05).After knocked down MSTN gene,P21 expression decreased(P<0.05),but CDK2 gene expression increased(P<0.05).These results indicated that MSTN gene expression was associated with P21 and CDK2,the proliferation of skeletal muscle satellite cells could be promoted while MSTN was inhibited,which provided a theoretical basis for the study on transgenic cattle.     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

太湖猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

以太湖猪皮肤为材料,采用组织块法培养成纤维细胞,并对其进行生物学特性检测,包括细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后接种的存活率测定、生长曲线绘制、染色体核型分析。结果表明:所培养的成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后接种的存活率分别为96·5%和93·2%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为72h;对所制备的染色体片核型分析显示2n=38,XY。本次实验成功地建立了太湖猪成纤维细胞系,为在细胞水平上保存太湖猪种质资源提供了可能,并为其他研究提供了实验材料。     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。