中国水牛瘤胃纤毛虫分布与挥发性脂肪酸的研究

对中国广西西林水牛和摩拉水牛瘤胃纤毛虫种类分布进行了鉴定检测,并测定了其瘤胃液挥发性脂肪酸浓度,同时进行了比较研究。全部检出17属63种25型瘤胃纤毛虫,比以前进行的8种反刍动物瘤胃纤毛虫分布研究中出现的总数和每个宿主个体中出现的平均纤毛虫种数多,种类构成最复杂,其纤毛虫构成特点类似于东南亚地区水牛瘤胃纤毛虫构成特点。其中广西西林水牛中检出了Entodinium biconcavumsp n,是至今从未鉴定记载过的认为是新种的特殊种类。广西西林水牛检出13属54种20型、摩拉水牛检出16属45种11型瘤胃纤毛虫。广西西林水牛瘤胃纤毛虫平均密度为2.13×105/mL,摩拉水牛瘤胃纤毛虫密度为3.43×105/mL。中国水牛瘤胃纤毛虫属别构成中Entodinium属出现率最高,但两个水牛品种间存在明显差别,其他属别构成也不尽一致。这与不同品种原来的地理环境分布与饲养管理条件有关。广西西林水牛瘤胃总VFA浓度为75.60 mmol/mL,摩拉水牛的为58.74 mmol/mL。瘤胃总VFA含量中均为乙酸含量最高,属于典型的粗饲料发酵类型。     

保护性赖氨酸对荷斯坦牛挥发性脂肪酸及菌体蛋白的影响

本试验选用3头装有永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的荷斯坦牛,分4个阶段,分别饲喂日粮Ⅰ(基础日粮+保护性赖氨酸Ⅰ30g/d)、日粮Ⅱ(基础日粮+保护性赖氨酸Ⅱ30g/d)、日粮Ⅲ(基础日粮+保护性赖氨酸Ⅲ30g/d)和日粮Ⅳ(基础日粮),研究以不同比例棕榈油脂肪粉包被的赖氨酸对瘤胃液挥发性脂肪酸和菌体蛋白的影响。结果表明,添加瘤胃保护性赖氨酸对瘤胃液挥发性脂肪酸和菌体蛋白均无明显影响(P>0.05)。瘤胃保护性氨基酸没有改变瘤胃内环境,不影响瘤胃微生物的生长和菌体蛋白的合成。     

微量元素钴对人工瘤胃挥发性脂肪酸产生量的影响

钴是瘤胃微生物活动不可缺少的元素,为研究日粮添加无机钴对瘤胃微生物发酵挥发性脂肪酸(VFA)产生量的影响,本试验用人工瘤胃模拟装置研究添加不同水平钴(0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/kg DM)对体外瘤胃微生物发酵的影响.结果表明,与不添加的对照组相比,添加钴可使发酵液的总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度明显增加(P<0.05),但对乙酸、丙酸、丁酸的摩尔比例没有显著影响(P>0.05),总的来说,添加钻明显促进瘤胃微生物对饲料养分的发酵.     

苹果酸对山羊瘤胃挥发性脂肪酸浓度动态变化影响的研究

选用4头装有永久性瘤胃瘘管的土地山羊为试验动物,按4×4拉丁方试验设计,进行了苹果酸(5 g、10 g、15 g)对山羊瘤胃内挥发性脂肪酸浓度动态变化影响的研究。结果表明,在0~12 h内,10 g和15 g添加组的pH值始终高于6.0,分别比对照组提高了0.16~0.27和0.19~0.41。10 g和15 g处理组的丙酸浓度几乎在12 h内均高于对照组。4 h时,10 g和15 g处理组的丙酸浓度分别比对照组提高了22%(P<0.05)和23%(P<0.05)。10 g和15 g处理组的丙酸比例在0~12 h内分别比对照组提高了21%~56%和22%~61%,10 g和15 g处理组的乙丙比在0~12 h内分别比对照组降低了21%~41%和21%~43%。结果表明,苹果酸降低了瘤胃液乙丙比,改变了瘤胃发酵类型。     

苹果酸对山羊瘤胃挥发性脂肪酸浓度动态变化影响的研究

选用4头装有永久性瘤胃瘘管的土地山羊为试验动物,按4×4拉丁方试验设计,进行了苹果酸(5 g、10 g、15 g)对山羊瘤胃内挥发性脂肪酸浓度动态变化影响的研究.结果表明,在0～12 h内,10 g和15 g添加组的pH值始终高于6.0,分别比对照组提高了0.16～0.27和0.19～0.41.10 g和15 g处理组的丙酸浓度几乎在12 h内均高于对照组.4 h时,10 g和15 g处理组的丙酸浓度分别比对照组提高了22%(P＜0.05)和23%(P＜0.05).10 g和15 g 处理组的丙酸比例在0～12 h内分别比对照组提高了21%～56%和22%～61%,10 g和15 g处理组的乙丙比在0～12 h内分别比对照组降低了21%～41%和21%～43%.结果表明,苹果酸降低了瘤胃液乙丙比,改变了瘤胃发酵类型.     

丙酮酸钙对山羊瘤胃挥发性脂肪酸浓度动态变化的影响

以8只装有永久性瘤胃瘘管的成年徐淮山羊为试验动物,采用自身对照设计,研究丙酮酸钙对山羊瘤胃内挥发性脂肪酸浓度动态变化的影响。结果表明:与对照组相比,添喂丙酮酸钙后,在0~8h内,对pH值无显著影响。4h时,总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度升高25%(P<0.01);丙酸浓度升高60%(P<0.01)。0~8h内,丙酸比例均高于对照组(17%~30%);乙丙比均低于对照组(20%~29%)。说明在山羊日粮中添加一定量丙酮酸钙,可在不影响pH值的情况下,提高丙酸比例,降低乙丙比,改变瘤胃发酵类型。     

丙酮酸钙对山羊瘤胃挥发性脂肪酸浓度动态变化的影响

以8只装有永久性瘤胃瘘管的成年徐淮山羊为试验动物,采用自身对照设计,研究丙酮酸钙对山羊瘤胃内挥发性脂肪酸浓度动态变化的影响.结果表明:与对照组相比,添喂丙酮酸钙后,在0～8h内,对pH值无显著影响.4h时,总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度升高25%(P<0.01);丙酸浓度升高60%(P<0.01).0～8h内,丙酸比例均高于对照组(17%～30%);乙丙比均低于对照组(20%～29%).说明在山羊日粮中添加一定量丙酮酸钙,可在不影响pH值的情况下,提高丙酸比例,降低乙丙比,改变瘤胃发酵类型.     

不同种类牧草对山羊瘤胃挥发性脂肪酸变化规律的研究

研究山羊瘤胃内放入装有不同种类牧草的尼龙袋后,瘤胃挥发性脂肪酸浓度的动态变化规律。选用带有瘤胃瘘管的山羊为实验动物,结合尼龙袋法测定3类牧草在山羊瘤胃中的挥发性脂肪酸浓度。结果表明,添加装有不同牧草的尼龙袋后,山羊瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度及乙酸／丙酸值均呈先上升后下降的规律,并在4h达到峰值,其中乙酸浓度约为70．49％、丙酸浓度约为15．38％,瘤胃的发酵类型总体上偏向于乙酸-丙酸型．3类牧草均适用于山羊的科学饲养。由此可见,添加装有不同种类牧草的尼龙袋均会对山羊瘤胃挥发性脂肪酸产生影响,其原因主要与原料的蛋白质含量有关。     

脂肪酸组合对体外瘤胃微生物发酵挥发性脂肪酸的影响

为研究长链脂肪酸组合对体外培养瘤胃微生物发酵挥发性脂肪酸（VFA）的影响,并得出最优脂肪酸组合及添加水平,试验选取硬脂酸、油酸、亚油酸及α-亚麻酸4种脂肪酸因子,设置0.5%、1.0%、1.5%等3个水平进行L₉（3⁴）正交试验,其中Ⅰ~Ⅸ组为试验组、Ⅹ组为对照组,各处理均设3个重复。以3头瘤胃瘘管山羊为瘤胃液供体进行体外发酵试验,测定各组培养液VFA 24 h内的动态变化。结果显示,各组的总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度总体上呈先上升后下降再上升的波动变化趋势。其中在6 h时Ⅶ组TVFA浓度最高。乙酸/丙酸比值总体呈下降趋势,6 h前下降较快,6 h后趋于平缓。丁酸摩尔百分比在7.97%~15.41%间变动。主成分与最优组合分析表明,TVFA浓度影响的主次顺序为亚油酸、油酸、硬脂酸、α-亚麻酸;以添加1.5%硬脂酸、0.5%油酸、1.5%亚油酸、0.5%α-亚麻酸时组合效应最好。     

不同加工处理日粮对绵羊瘤胃挥发性脂肪酸的影响

选用3只健康并安装永久性瘤胃瘘管的杂种羯羊,平均体重为24 kg,采用3×3无重复拉丁方试验设计,用3种不同日粮(全混合颗粒料日粮、粉碎精料+铡短粗料日粮和未粉碎精料+铡短粗料日粮)来研究对绵羊瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)浓度的影响。结果表明,采食未粉碎精料+铡短粗料日粮绵羊的瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度显著高于采食全混合颗粒料日粮绵羊(P＜0.05),采食未粉碎精料+铡短粗料及粉碎精料+铡短粗料日粮的绵羊瘤胃丙酸摩尔比显著或极显著高于采食全混合颗粒料日粮绵羊(P＜0.05,P＜0.01),而(戊酸+异戊酸)摩尔比极显著低于全混合颗粒料日粮绵羊(P＜0.01),乙酸/丙酸显著或极显著低于采食全混合颗粒料日粮绵羊(P＜0.05,P＜0.01)。因此,用粉碎精料+铡短粗料或未粉碎精料+铡短粗料日粮饲喂绵羊能改善绵羊瘤胃发酵类型。     

纳米铜对绵羊瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸的影响

试验采用体外发酵法,研究在人工瘤胃液中添加不同浓度（0、50、100、150、200、400、800、1200、2400、4800μg/L）的纳米铜时,对绵羊瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸的影响。试验共分10个处理组,每个处理组3个重复。结果表明：纳米铜在添加量为100-400μg/L时,乙酸浓度和总挥发性脂肪酸浓度都显著高于对照组和其他试验组（P〈0.05）。说明在体外发酵条件下添加适量的纳米铜对瘤胃微生物的发酵有促进作用。     

气相色谱-质谱联用法测定瘤胃液中的甲酸和其他6种挥发性脂肪酸

本试验旨在建立一种测定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的气相色谱-质谱联用方法。样品选用湘东黑山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液,18000 r/min离心10 min,取上层清液。将上层清液与25%的偏磷酸按照9∶1(v∶v)的比例混合均匀,静置0.5 h后,4℃条件下18000 r/min离心10 min,取上清液过0.22μm滤膜,进行气相色谱-质谱分析。以DB-FFAP毛细管柱进行分离,甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸在9 min内达到基线分离。结果表明:这7种组分色谱峰保留时间的相对标准偏差均小于0.5%,峰面积的相对标准偏差均小于5.0%。甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸分别在0.8~121.0μg/mL、0.3~3081.0μg/mL、0.4~1165.2μg/mL、0.4~275.1μg/mL、0.2~543.0μg/mL、0.5~129.9μg/mL和0.4~271.5μg/mL内线性关系良好,线性相关系数均达到0.998以上,检出限(3倍信噪比)在0.069~0.252μg/mL。山羊和奶牛瘤胃液样品的加标回收率分别为91.8%~103.8%和78.7%~95.2%。本试验建立的测定瘤胃液中甲酸以及其他6种挥发性脂肪酸的气相色谱-质谱联用方法选择性强、样品用量少、操作简单,可为反刍动物瘤胃碳水化合物代谢及甲烷生成的相关研究提供技术支撑。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Met对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理(每个处理6个重复),培养液中Met浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。在37℃、5%CO2条件下培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Met浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。0.52~0.78 mmol/L Met处理BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)和PPARγ基因的相对表达量均显著高于其他处理(P0.05)。BMECs内脂蛋白脂酶(LPL)基因的相对表达量以0.26~0.39 mmol/L Met处理较高,显著高于0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。脂肪酸合成酶(FASN)基因的相对表达量以0.39~0.52 mmol/L Met处理较高,且0.52 mmol/L Met处理显著高于0.13~0.26 mmol/L和0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。Met浓度可显著影响SREBP1和乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达(P0.05),均以0.26 mmol/L Met处理的相对表达量最高。结果表明,Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因的表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1的基因和蛋白的表达,Met浓度为0.26~0.52 mmol/L时对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。     

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。     

油酸和硬脂酸对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸结合蛋白3表达和脂滴分泌的影响

为确定外源添加长链脂肪酸油酸和硬脂酸对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸结合蛋白3（FABP3）表达的影响,本试验采用荧光定量RT-PCR检测乳脂合成相关基因的表达情况,确定油酸和硬脂酸的最佳浓度和培养时间分别为75 μmol/L 12 h和100 μmol/L 36 h。采用Western blotting和免疫荧光法检测添加油酸和硬脂酸后FABP3表达和脂滴分泌的情况,为进一步揭示FABP3在乳脂合成信号转导通路中的作用提供理论依据。     

过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立

本试验旨在利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,建立奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化损伤模型。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42组,每组10个重复。细胞培养液中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L H2O2,使之分别作用2、4、6、8、12、24 h,测定细胞数量,计算存活率。试验二是在试验一得出的适宜H2O2作用时间(本试验的结果为6 h)的基础上,采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组,每组6个重复,BMEC中添加不同浓度的H2O2(0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L)作用细胞6 h,收集细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2作用浓度。试验一结果表明,600μmol/L H2O2作用细胞6 h,BMEC的存活率降低至79.79%。试验二结果表明,600~1 000μmol/L组与其他各组相比均显著降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了丙二醛含量(P<0.05),但600、800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)。结果 提示,H2O2作用浓度为600μmol/L、作用时间为6 h,使BMEC产生了明显的氧化应激,可作为建立细胞氧化损伤模型时的适宜条件。     

脂肪酸结合蛋白5对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的影响

脂肪酸结合蛋白5（fatty acid binding protein 5,FABP5）是一种胞内脂质运载体。本试验应用甘油三酯测定法及BODIPY染色法检测奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell,BMEC）中甘油三酯及脂滴分泌情况,采用实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测BMECs中FABP5对固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）的表达影响。结果显示,试验成功获得高纯度的BMECs,构建了pGCMV-IRES-EGFP-FABP5真核表达载体,且与空白对照组和空载体组相比,FABP5过表达组的甘油三酯和脂滴分泌量极显著增加（P<0.01）,同时SREBP-1c及靶基因FAS、ACC的表达量均极显著增加（P<0.01）;试验成功筛选了FABP5 siRNA1为最佳干扰片段,当FABP5抑制时,抑制组的甘油三酯、脂滴分泌量极显著减少（P<0.01）,SREBP-1c、FAS、ACC的表达量均极显著降低（P<0.01）。表明FABP5可通过上调SREBP-1c的表达从而促进BMEC中乳脂的合成。     

Effect of Fatty Acid Binding Protein 5 on Milk Fat Synthesis of Bovine Mammary Epithelial Cells

The fatty acid binding protein 5 (FABP5) is an intracellular lipid carrier. The TG GPO-POD assay kit and BODIPY staining methods were used to detect lipid secretion and triglyceride content,and the effect of FABP5 on SREBP-1c expression were detected by Real-time PCR and Western blotting methods. The results showed that high purity bovine mammary epithelial cells (BMECs) were successfully isolated and purified,and the eukaryotic expression vector pGCMV-IRES-EGFP-FABP5 was constructed in this experiment. Compared with the blank control group and empty vector group,the lipid secretion and triglyceride content, and the expression of SREBP-1c and FAS,ACC were extremely significantly increased when the FABP5 was overexpressed (P<0.01). FABP5 siRNA1 was selected as the optimal interference fragment, and when FABP5 was inhibited,the lipid secretion and triglyceride content,the expression of SREBP-1c,FAS and ACC were extremely significantly decreased (P<0.01).The results indicated that FABP5 could promote the synthesis of milk fat in BMEC by up-regulating the expression of SREBP-1c.