2020-2021年河南省猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化及S蛋白变异分析

2020-2021年在河南省18个地区共收集499份发生腹泻的仔猪临床样品,采用RT-PCR进行猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)筛查。结果显示,共检测出162份阳性样品,阳性率为35.2%。对其中21株PEDV流行毒株S基因进行了测序、同源性比对和遗传进化分析,结果显示21株PEDV流行毒株之间核苷酸同源性为96.9%～100%,氨基酸同源性为95.2%～100%。与52株2011-2019年国内流行毒株之间的核苷酸同源性为95.1%～99.5%,氨基酸同源性为91%～99.8%。遗传进化结果显示,21株PEDV毒株均属于GⅡb群。氨基酸序列比对显示,流行毒株S蛋白存在7处新的且规律的氨基酸突变。本试验对现阶段我国所流行的PEDV S基因进行测序分析,为了解PEDV流行毒株遗传变异趋势和研发新的有效疫苗提供参考。     

近期暴发仔猪流行性腹泻的探讨

2011年底,全国很多地区暴发猪流行性腹泻疫情,给我国的养猪业造成了巨大的损失.福建省福州、厦门、南平等地也发生多起仔猪流行性腹泻,经济损失巨大.采用RT-PCR检测证明是猪群感染了流行性腹泻病毒(PEDV),对扩增片段进行测序,结果表明检测到的流行性腹泻病毒的S基因发生了变异,是由流行性腹泻病毒变异株引起的.S基因序列分析发现该毒株与韩国毒株同源性高.猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典毒株与变异毒株共存.许多专家采用多种防控措施,获得很多经验,但都不理想.对于流行性腹泻病毒的防控,借鉴外国的经验,采用青岛易邦的流行性腹泻病毒变异株冻干活苗口服防疫效果明显,初生乳猪的发病率降低至5%,死亡率降低至2%.     

河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

为了解当前河北地区猪腹泻主要相关病毒流行情况,对2016年4月—2017年2月收集的河北地区腹泻样品,采用荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒,并对扩增获得的9株PEDV S基因进行测序和序列分析。结果显示,全年腹泻病发生率为9.70%,在春冬季节多发。其中猪流行性腹泻病毒检出率最高,为13.89%,其在仔猪中检出率为19.28%,在育肥猪中检出率为17.24%。对PEDV S基因氨基酸序列分析显示,目前河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2个进化分支,部分毒株发生多处独特氨基酸突变。本研究表明,2016年河北地区PEDV对仔猪的感染情况有所缓解,而对育肥猪感染率较高,PEDV流行毒株S蛋白进化分支和突变较多提示PEDV流行毒株毒力和抗原活性可能发生改变。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)辽宁株序列测定及分析

为弄清2014年沈阳某猪场腹泻原因,应用RT-PCR方法对采自该场样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1基因扩增,并将产物纯化后测序、分析。结果得到长为2 376 bp的S1基因序列;本病毒与2013年美国暴发毒株以及我国2010年毒株核苷酸和氨基酸同源性较高,而与疫苗株同源性较低;同时存在氨基酸的插入、缺失及糖基化位点的改变;在进化树上,与2010-2011年在我国暴发的猪流行性腹泻病毒为与同一亚群,与2013年美国毒株也有较近的亲缘关系。表明分离到猪流行性腹泻病毒,此病毒已发生部分变异,需给予密切重视。     

一例猪流行性腹泻病毒变异株引起仔猪腹泻的诊断

2020年11月初,福建南平某猪场仔猪发病,临床症状以腹泻、呕吐等为主。为确定病因,采集发病仔猪小肠组织,提取核酸分别检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德塔冠状病毒等,结果仅检出猪流行性腹泻病毒,且通过对该毒株的S1基因进行扩增、测序与分析,发现该毒株与国内流行变异株对于序列同源性超过97.4%,但与疫苗株同源性相对较低,仅为92.2%,因此可判定该猪场流行的PEDV毒株为变异株。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S基因截短表达与抗原性分析

临床分离获得1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),对其纤突(S)基因5'端序列分析比较表明,该分离株(NB2011)与目前国内流行的猪流行性腹泻病毒毒株同源性为99%以上,与经典毒株(CV777)的同源性仅为82.6%。经氨基酸分析比较,PEDV纤突蛋白发生明显变异,在抗原位点35-55aa以及100-145aa区间存在很大差异。本试验对CV777株与临床分离的NB2011株的S基因N端差异较大的区段(CV777-S661,NB-S673)进行原核表达,分别获得经典株和流行株S基因N端表达蛋白。Western blotting结果表明,S661和S673重组蛋白均能与PEDV阳性血清产生特异性反应,且不与PEDV阴性血清反应。对两种蛋白进行交叉斑点试验,结果表明两者在反应原性上存在差异。研究结果为进一步阐明PEDV流行毒株抗原表位的变异及研究PEDV免疫保护机制打下基础。     

一例猪流行性腹泻病毒变异株导致仔猪腹泻的案例诊断

2020年11月初,福建南平某猪场仔猪开始发病,其临床症状以腹泻、呕吐等为主。为确定病因,猪场工作人员采集发病仔猪小肠等组织送至武夷山市农业农村局,工作人员分别检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等病原,结果仅在肠道组织中检测出PEDV(猪流行性腹泻病毒),且通过对该毒株的S1基因进行扩增、测序与分析发现,该毒株与国内流行变异株对应序列同源性超过97.4%,但与疫苗株同源性相对较低,仅为92.2%。因此可判定该猪场流行的PEDV毒株为变异株,此结果为该猪场猪流行性腹泻的防控提供科学依据。     

大理某规模化猪场仔猪流行性腹泻诊断及防制

2021年10月初,大理某规模化猪场仔猪出现严重腹泻、呕吐等症状,且病死率较高。为确定发病原因,采集腹泻死亡仔猪淋巴结、肺脏、肝脏、肾脏和小肠等组织样品,采用real-time PCR法分别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德塔冠状病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒等核酸,结果仅在肠组织病料中检测到PEDV核酸,未检测到其他病原核酸。进一步对1份PEDV阳性样品的S1基因片段进行RT-PCR扩增、测序与分析,发现该毒株S1基因部分序列与国内流行变异株(JN599150.1)同源性为99.8%,与CV777疫苗株同源性仅92.5%,提示该毒株为变异株。研究结果表明,该猪场仔猪腹泻是由PEDV变异株感染所引起,通过采取系列防制措施后该病得到有效控制。     

2017年河南省猪流行性腹泻病毒检测及基于S1基因片段的遗传变异分析

为了解河南省引起仔猪腹泻的猪肠道冠状病毒的感染和流行情况,我们对2017年度发生仔猪腹泻的河南省25家养殖场送检的94份仔猪肠道或粪便样品开展了相关检测。结果显示猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)的样品检出率为68.1%(64/94),猪场阳性率为76.0%(19/25),但未检测到猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDcoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。为进一步分析PEDV的遗传变异情况,利用RT-PCR和基因克隆测序技术,我们成功获得了8株PEDV的S1基因片段的核苷酸序列。分子进化树分析显示,我国流行毒株可以分为G1a(疫苗及其衍生株)、G1b(经典毒株)、G2a(2011-2013年变异株)、G2b(2016-2017年变异株)和G2c(重组毒株)5个进化分支,本研究获得的S1基因序列均处于G2b进化分支,且与2016-2017年间的流行毒株遗传距离更近。同源性分析显示,8株分离株彼此之间S1基因片段的核苷酸同源性为97.3%～99.5%,与变异毒株AJ1102的同源性为97.2%～98.0%,而与经典毒株CV777、CH/S的同源性仅为91.0%～92.3%。氨基酸序列比对分析显示,与CV777和CH/S等经典毒株相比,分离株S1基因片段除了多个氨基酸位点发生变异外,在~(58)NQGV~(61)、~(140)N、~(157)H这3个位置有氨基酸的插入,在~(163)NI~(164 )有2个氨基酸的缺失,这与之前关于PEDV变异株的研究报道相一致。此外,与其他变异株相比,本研究发现分离株HeNPDS/2017在491位有1个新的丝氨酸(Ser)缺失位点,其生物学意义有待进一步研究。本研究丰富了PEDV的分子流行病学数据,有助于了解河南省PEDV流行和遗传变异的最新情况,为该地区猪流行性腹泻病的防控提供一定的参考。     

10株猪流行性腹泻病毒序列分析

为了分析2015-2018年北方地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,通过RT-PCR分段扩增、测序,获得10株PEDV S基因序列。分析发现,10株S基因核苷酸序列同源性为96.8%～99.4%,推导编码的氨基酸序列同源性为96.5%～99.3%;与参考株核苷酸序列同源性为93.4%～99.5%,与参考株氨基酸序列同源性为92.0%～99.4%。其中,4株序列基因长度均为4 161 nt,编码1 386个氨基酸;6株序列基因长度均为4 158 nt,编码1 385个氨基酸,与目前流行的变异株和经典株CV777相比,这6株S基因推导的氨基酸序列已分别在131位、1 196位出现1个氨基酸缺失,在进化树中已形成多个小分支。由此表明,我国PEDV在流行过程中已出现较大变异。作者研究结果为监测和分析我国PEDV的变异和演化提供了有价值的基因信息数据。     

猪流行性腹泻病毒山东分离株SD-2016的S基因序列分析

为研究本实验室分离的SD-2016分离株S基因序列特点,设计扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因的2对引物,将扩增出的目的片段与克隆载体连接后测序,利用分子生物学软件对目的基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对分析。结果:SD-2016毒株与CV777、LZC等GI群的毒株在核苷酸序列同源性比对结果为93.8%~95.0%,氨基酸序列同源性比对结果在92.5%~94.1%。绘制系统发育进化树发现,SD-2016株与中国广东分离株GD12、湖南分离株HUN在一个分支上,亲缘关系较近。对S基因的中和表位进行分析发现主要的氨基酸位点突变集中于抗原表位区COE区域(第499-638位氨基酸)和SS6(第764-771位氨基酸),分别有6个位点和2个位点的突变。通过对SD-2016分离株S基因的分析,为以后猪流行性腹泻病的基因工程疫苗研制提供参考。     

河南部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查

试验对临床上可引起腹泻的部分病原进行了检测,并对河南部分地区的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)进行了分子流行性病学调查。对从河南地区5个规模化猪场获得的10份腹泻病料进行了反转录PCR,并对检出的8份PEDV的S基因部分序列进行测序、同源性和遗传进化分析。结果显示,临床的腹泻病例部分为混合感染,作为主要病原的PEDV、猪A群轮状病毒(PoRV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检出率有所不同。将8株PEDV的S基因与参考毒株CV777进行比较,S基因存在不同位点和不同程度的氨基酸突变。S基因的同源性比较和遗传进化分析表明:河南地区的8株PEDV毒株属于不同的分支,且181737-1、181737-2和180278-1为流行株,180276-3、180276-6、180435-1和181753-1更接近于经典株,181212-1更接近于疫苗株。结果表明,河南地区现阶段流行的PEDV毒株复杂多样,优势毒株可能发生了变化。     

江苏地区猪流行性腹泻流行病学调查及病原S基因序列分析

为探究江苏省内猪场猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行和遗传变异情况,采集江苏省13个地级市规模猪场和屠宰场健康猪群的鼻拭子和肛拭子样品,通过RT-PCR方法检测PEDV,并对部分阳性样品进行S基因序列扩增、测序及遗传进化分析。结果显示：259份猪鼻拭子样品中,PEDV阳性检出率为10.42%(27/259);178份猪肛拭子样品中,PEDV阳性检出率为9.55%(17/178)。选取的8株PEDV代表株的核苷酸序列同源性在99.2%～100%之间,氨基酸序列同源性在95.2%～97.1%之间,与国内流行毒株SD-M、JS2008的同源性最高,核苷酸序列同源性达到97%以上;遗传进化分析显示,8株PEDV代表株属于同一群,与经典毒株CV777、DR13亲缘关系较近。本研究初步明确了江苏地区健康猪群中猪流行性腹泻流行状况和PEDV遗传演化特点,为有效防控猪流行性腹泻提供参考。     

云南省某腹泻仔猪群猪流行性腹泻病毒核酸检测及其N基因序列分析

猪流行性腹泻是猪场新生仔猪腹泻的主要病原之一。为确定云南省曲靖市某猪场新生仔猪出现呕吐、腹泻和高死亡率的病因,采集病死仔猪肠道、肠系膜淋巴结、脾脏等组织病料,处理后提取病原核酸,通过RT-PCR进行导致仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原核酸检测。结果显示,仅PEDV核酸阳性,其他病原均为阴性。对检出的PEDV阳性样品N基因进行序列分析发现：阳性样品N基因与河北的T10-HB2018毒株核苷酸同源性最高,为99.7%;与疫苗株AJ1102和LW/L毒株核苷酸同源性为97.4%~97.5%,在同一个分支上,均属于基因II群;与经典毒株CV777株核苷酸同源性略低,为95.7%。结果表明,引起该仔猪群腹泻的主要病因为PEDV感染,流行毒株未发生变异,当前疫苗对其防控有效。依据分析结果,该场采取PEDV疫苗紧急免疫,使疫情得到有效控制。本研究对于指导该地区猪群腹泻病防控具有参考意义。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了解2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株变异及遗传进化情况，试验从多个地区的51家猪场采集340份疑似感染PEDV的猪小肠组织、粪便和肛拭子，提取病毒核酸后采用RT-PCR方法扩增S1、M和ORF3基因并测序，与GenBank中PEDV参考毒株进行比对分析，利用生物信息学软件构建遗传进化树，分析核苷酸序列同源性及氨基酸序列。结果表明：共获得57份PEDV阳性样品，来源于14家猪场，猪场阳性率为27.5%,并对从阳性猪场获得的14株毒株进行命名。与经典毒株CV777相比，14株PEDV毒株的S1、M和ORF3基因均出现不同程度的氨基酸突变。在14株毒株的S1基因中，Heyuan2021-7毒株位于G1-2分支，其余13株位于G2分支，14株毒株与参考毒株GD-A核苷酸序列的相似性较高，为89.3%～99.9%,存在多处氨基酸的缺失和插入。在M基因中，14株毒株位于G2分支且与参考毒株FR-001核苷酸序列的相似性为98.1%～99.7%,只存在氨基酸突变。在ORF3基因中，FC2021-1、GD...     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%～99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位(P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6)和1个中和抗原表位(SID)均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

为了了解四川地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生物学特征及基因的遗传进化关系,从四川某地采集了发病仔猪小肠,病料处理后在Vero细胞上进行盲传,通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）验证,成功分离出1株猪流行性腹泻病毒,命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S1序列与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%,与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。试验成功地从四川省分离鉴定得到1株猪流行性腹泻病毒,为该地区PEDV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。