山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

猪A-FABP基因真核表达载体的构建及其组织表达

本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。     

绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138 bp的转录产物,并用Western blotting检测到78 ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。     

长白猪CIDEB基因真核表达载体构建及生物信息学分析

本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。     

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family,member A,Rhoa）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2,Ptgs2）分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列（登录号：JN971019.1和NM_011198）设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用Lipofectamine^TM 2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。     

绵羊肺炎支原体标准株Y98外膜蛋白MOP30基因真核表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

以绵羊肺炎支原体（Mycoplasma oumvipneoniae,MO）标准株Y98基因组为模板,设计1对特异引物,PCR扩增得到798bp的P30目的基因（MOP30）,将其定向克隆到pMD19-T Simple载体中进行测序分析。重组质粒进行XbaⅠ/BamHⅠ双酶切并回收目的片段,将目的基因亚克隆入黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein,YFP）表达载体pCAMBIA1300-YFP中构建重组融合表达质粒pCAMBIA1300-MOP30-YFP。双酶切验证后的融合表达质粒转化农杆菌（Agrobacterium）感受态细胞,侵染烟草（tobacco）叶片。通过激光共聚焦成像显微镜（cofocal imagingmicroscope）观察到融合表达的黄色荧光蛋白,Western-blotting试验得到57 000的特异条带,RT-PCR检测到MOP30基因在烟草叶片中转录。MOP30-YFP融合蛋白在烟草中的成功表达,为转基因植物疫苗防治绵羊支原体肺炎奠定了基础。     

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。     

旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

杜仲叶对绵羊肝脏糖代谢及其相关基因表达的影响

本试验旨在研究杜仲叶(EUL)对绵羊肝脏糖代谢及其相关基因表达的影响。随机选取6~8月龄、体重35~40kg的绵羊(杜泊羊×湖羊♀)12只,平均分为2组,分别为对照组(CTL组)和EUL组(饲粮中添加10%EUL),每组6只。预试期10d,正试期30d。采集血液,测定糖代谢相关指标;采集肝脏组织,用于转录组学测序、糖代谢相关酶及核转录因子的mRNA及蛋白表达量分析。结果表明:1)与CTL组相比,EUL组血浆葡萄糖(GLU)、血清胰高血糖素(GC)含量显著降低(P<0.05),血清胰岛素(INS)含量显著升高(P<0.05)。2)转录组学检测结果表明,差异显著基因与糖代谢和能量代谢密切相关,且其在与糖代谢相关的通路中显著富集。3)荧光定量PCR检测结果表明,与CTL组相比,EUL组肝脏胰岛素受体(INSR)及胰岛素受体底物2(IRS2)的mRNA表达量极显著升高(P<0.01),胰高血糖素受体(GCGR)的mRNA表达量极显著降低(P<0.01);糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFKL)的mRNA表达量显著上调(P<0.05);糖异生相关酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)mRNA表达量极显著下调(P<0.01),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)的mRNA表达量显著下调(P<0.05);调控糖异生的叉头转录因子1(FoxO1)和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(CREB)的mRNA表达量均极显著下调(P<0.01);肝糖原合成关键酶糖原合酶2(Gys2)的mRNA表达量极显著上调(P<0.01)。4)Westernblot结果显示,与CTL组相比,EUL组INSR蛋白表达量无显著变化(P>0.05);FoxO1、G6Pase和PEPCK1蛋白表达量均极显著下调(P<0.01)。综上所述,EUL显著影响绵羊机体的糖代谢,提高糖酵解关键酶基因的表达,抑制糖异生相关转录因子及酶基因的表达,并促进肝糖原的合成,进而降低血糖。     

巴什拜羊SPLUNC1基因的克隆与真核表达

为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748 bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53 ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。     

努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达

【目的】 扩增努比亚山羊LIM结构域基因1（LIM domain gene 1,LMCD1）并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】 从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】 努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1 092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C₁₇₇₅H₂₈₁₈N₅₀₈O₅₃₃S₂₉,分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高（99.8%）,与斑马鱼相似性最低（55.4%）,与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】 试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。     

绵羊c-Myc与EGFP融合蛋白的真核表达及其对细胞增殖的调控作用

为了探讨c-Myc基因对细胞增殖及相关基因表达的调控作用,本试验构建了c-Myc-（G₄S）₃-EGFP融合基因的真核表达载体pc-Myc-EGFP,并利用生物信息学分析了其结构和理化特征。转染后分别通过细胞计数和qRT-PCR检测了其对绵羊胚胎成纤维细胞（sheep embryonic fibroblasts,SEF）增殖及相关基因表达的影响,并利用启动子分析软件解析了相应的表达调控机制。酶切鉴定和测序结果表明,载体构建成功。生物信息学分析表明,绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核,含有螺旋环螺旋（helix-loop-helix,HLH）结构域,其分子量为48 474.78 u。融合蛋白c-Myc-（G₄S）₃-EGFP有较强的亲水性,且含有31个磷酸化位点。因（G₄S）₃有较高的灵活度（9.848 5）,两侧的c-Myc和EGFP都保持各自的空间构象且互不干扰。进一步的细胞试验结果表明,重组质粒pc-Myc-EGFP在SEF中能够表达。过表达c-Myc促进了SEF的增殖,使cyclin D2、Cdk4、Cdk6、cyclin E1、cyclin A2、cdc25A mRNA的表达水平分别升高至5.20、3.10、6.54、6.52、23.37和8.22倍（P<0.01）,E2F1 mRNA的表达升高至1.83倍（P<0.05）。启动子分析结果表明,各基因的5'调控区存在c-Myc和E2F1的结合元件。综上所述,绵羊c-Myc通过上调细胞周期相关基因的表达促进SEF细胞增殖,c-Myc的作用机制可能是通过直接作用于靶基因5'调控区的E-box元件,也可能是通过其他转录因子（如E2F1）的间接调控作用而实现。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank已登录的猪囊尾蚴膜联蛋白B2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪囊尾蚴中扩增出膜联蛋白B2基因,将其克隆至pcDNA3.1表达载体上,经酶切鉴定和基因测序表明,目的基因AnnexinB2已正确地整合至表达质粒中,成功构建了膜联蛋白B2基因的真核表达载体.     

猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达

试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C₃₁₈₉H₅₁₅₃N₈₆₅O₁₀₁₉S₁₃。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。