弓形虫MIC10基因的克隆与表达

弓形虫MIC10基因在速殖子时期与缓殖子时期都存在不同程度的表达,但国内对该基因的研究甚少。为了解弓形虫MIC10基因的功能,构建其原核表达载体,并进行原核表达。本试验以提取的弓形虫DNA为模板,设计引物扩增MIC10基因片段,连接克隆载体pMD-18T和表达载体PGEX-4T-1,PCR和双酶切鉴定后进行原核表达。结果表明,经PCR扩增获得597 bp的MIC10基因片段,构建pMD18-T-MIC10克隆质粒和PGEX-4T-MIC10原核表达载体,经PCR鉴定和双酶切鉴定正确,并在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白的分子量约为49 kD。本试验为弓形虫MIC10基因功能的后续研究奠定了基础。     

弓形虫棒状蛋白ROP54编码基因的生物信息学分析及原核表达

为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白，本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列，并连接至pMD-18-T载体，构建出克隆质粒pMD-ROP54后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接，构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况，Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示，成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示，测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽，亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经，SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达，且能够被犬抗弓形虫血清识别，具有良好的反应原性。本研究成功...     

H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。     

弓形虫MIC10基因敲除株的构建及鉴定

为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株。结果表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH。本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。     

刚地弓形虫Rop18基因的原核表达及鉴定

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒部分N基因的原核表达及表达产物反应原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表达产物是否具有抗原性,并为建立PEDV的间接ELISA方法奠定基础,本试验应用RT-PCR技术扩增N基因的部分核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中。重组菌于37 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后进行SDS-PAGE分析,并进行Western blotting鉴定。结果显示,构建的原核表达重组质粒测序正确,且该蛋白与抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反应活性。本试验成功构建了PEDV部分N基因原核表达载体,为后续PEDV感染的血清学诊断方法的建立提供依据。     

Prokaryotic Expression of Partial N Gene Fragment of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Reactionogenicity Analysis of the Expressed Protein

This experiment was aimed to study the antigenicity of prokaryotic expression of the N gene fragment of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),and lay a foundation for establishing an indirect ELISA method of PEDV.The N gene segment was amplified by RT-PCR,then the recombinant plasmid with the vector pET-30a(+) was constructed,which was induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h.Furthermore,the expressed product was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.Sequencing results proved that recombinant plasmid was correctly constructed.The result showed that the PEDV polyclonal antibody could specifically bind to PEDV N protein,which indicated that the recombinant fusion protein had excellent immunogenicity.A prokaryotic expression vector for the fragment of N protein was successfully constructed in this study,which laid a foundation for the development of diagnosis of PEDV.     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因，将扩增产物与pGEM—Teasy载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting；用所表达的蛋白免疫小鼠，经ELISA检测血清抗体，验证其免疫原性。结果显示，所克隆的T24基因片段长716bp，含有1个678bp的开放阅读框，其编码226个氨基酸，与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％；表达的融合蛋白大小为40ku，并能被猪囊虫阳性血清识别；免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体，第30d达到较高水平，表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

【目的】克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。【方法】提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞(baby hamster syrian kidney, BHK-21);同时亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)检测其反应性。【结果】成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白(分子质量22 ku),...     

Construction and Analysis of Immune Response of Neospora caninum and Toxoplasma gondii Cross Recombinant Adenovirus Antigen AMA1 Gene

In order to establish AMA1 recombinant adenovirus of Neospora caninum (N.caninum) and Toxoplasma gondii (T.gondii), and analyze the immunogenicity of it, cross universal primers were designed according to the open reading frame of N. caninum and T. gondii AMA1 gene sequences. Based on pMD18T-NcAMA1 and pMD18T-TgAMA1 cloning plasmid, recombinant adenovirus shuttle plasmid ADV4-Nc/TgAMA1 was constructed. Then, ADV4-Nc/TgAMA1 and pacAd5 backbone plasmid were linearized and co-transfected 293T cells. After packaging recombinant adenovirus and measuring the virus titer, collected virus was inoculated into BALB/c mice, confirmed the IgG antibody levels by indirect ELISA method. The results showed that Nc/TgAMA1 was expressed in Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus, Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus titer was 10⁹ PFU/mL. IgG antibody levels in the Ad5-Nc/TgAMA1 vaccinated group were significantly higher than pVAX1-Nc/TgAMA1 plasmid group and PBS control group. This result indicated that the constructed Ad5-Nc/TgAMA1 recombinant adenovirus could induce specific humoral immune response in mice, this research laid a solid foundation for the development of a recombinant adenovirus vaccine against N. caninum and T. gondii.