猪m6A去甲基化酶FTO、ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌F18感染抗性的关系分析

为了探讨猪6-甲基腺嘌呤（m⁶A）去甲基化酶mRNA表达水平与仔猪大肠杆菌F18抗性的关系,本研究运用实时荧光定量PCR方法检测m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因在35日龄苏太猪断奶仔猪大肠杆菌F18抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织中的mRNA表达差异,同时分别利用F18ab、F18ac大肠杆菌菌体刺激和内毒素LPS诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测FTO、ALKBH5基因表达变化。结果表明,FTO、ALKBH5基因在抗性型个体十二指肠和空肠中的表达量均极显著或显著高于敏感型个体（P<0.01,P<0.05）;不同F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后,FTO基因表达水平均无显著变化（P>0.05）,而ALKBH5基因在F18ac刺激后表达量显著上调（P<0.05）;LPS诱导4 h时,FTO和ALKBH5基因表达量均显著上调（P<0.05）。本研究在细胞和个体水平上初步验证并发现了m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌感染仔猪密切相关,为今后深入研究RNA去甲基化修饰在仔猪细菌性腹泻调控中的作用机制提供了理论基础。     

CREBBP-m6A报告系统的建立和验证

N~6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m~6A)是真核生物信使RNA(Messenger RNA,mRNA)上最丰富的一种化学修饰,受到甲基转移酶和去甲基化酶的调控而呈现动态变化的状态。m~6A识别蛋白可识别并特异性结合到m~6A修饰位点,调控mRNA的剪接、降解和翻译进程,从而调节基因的表达。选择包含3个m~6A修饰位点的CREBBP基因3'UTR序列连接到红色荧光mCherry序列的下游,将得到的mCherry-CREBBP 3'UTR片段插入到pCD513B-CMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,得到CREBPP-m~6A报告质粒pCMV-mCherry-CREBBP,并在GC-1细胞和293T细胞中验证了CREBBP-m~6A报告质粒的功能,发现红色荧光强度和m~6A水平呈负相关。研究结果提示,可将pCMV-mCherry-CREBBP质粒转入靶细胞,通过红色荧光的强度来检测m~6A修饰的变化。     

家禽m6A修饰研究进展

N6-甲基腺嘌呤(m6A)作为一种重要的RNA表观遗传修饰方式,在真核生物基因组中广泛分布,已被证实在细胞分化、配子发生、脂肪沉积及肿瘤发生等生命过程中发挥重要作用。随着高通量检测技术和单碱基检测技术的快速发展,大量的m6A修饰调控蛋白被鉴定出来,相应的调控机理也得到了更深入的解析。文章综述了m6A的发现和特征、调控酶系统、检测技术、主要生物学功能及在家禽方面的研究进展,以期为后续对家禽m6A修饰的研究及应用提供理论支撑。     

m6A去甲基化酶FTO对猪肌卫星细胞分化的影响

【目的】探究N⁶-甲基腺苷(m⁶A)去甲基化酶FTO表达水平对猪肌卫星细胞分化的影响,并比较不同表型猪FTO表达和m⁶A甲基化修饰水平。【方法】收集分化第0、2和4天的猪肌卫星细胞,用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测FTO和肌球蛋白重链(MyHC)蛋白表达、肌分化因子(MyoD)和肌细胞生成素(MyoG)的mRNA表达水平;利用免疫荧光法检测肌卫星细胞分化标志基因MyHC表达情况;采用Dot blotting检测m⁶A甲基化修饰水平。将过表达载体(OE-FTO)、空白对照(NC)和FTO基因干扰载体(siRNA-FTO)、阴性对照(siRNA-NC)分别转染猪肌卫星细胞并诱导分化,检测FTO、肌细胞分化相关基因表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平,利用免疫荧光法检测MyHC表达以及肌管形成情况;利用Western blotting和Dot blotting分别检测大白猪、宁乡猪不同组织中FTO蛋白表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平。【...     

m6A表观遗传修饰及其调控机制研究进展

N⁶-甲基腺嘌呤（N⁶-methyladenosine,m⁶A）修饰是现阶段发现的真核生物体内最广泛的RNA表观遗传修饰方式,近年来研究显示,m⁶A在真核生物间具有较高的保守性,在基因表达及细胞命运调控中发挥着关键作用,且对mRNA的可变剪接、定位、翻译及稳定性有较大影响。现有的m⁶A修饰检测技术可以较为准确、高效地检测出生物样本中的m⁶A修饰丰度,并能快速、简便地进行m⁶A修饰的高通量测序,以及在单碱基分辨率下检测m⁶A修饰在RNA上的位置。尽管m⁶A修饰相关调控蛋白对畜禽复杂经济性状的影响近年来已有少量报道,但其中的作用机制仍未得到充分阐明。大量人类及模式生物上的研究表明,m⁶A修饰相关蛋白能够影响生长发育、繁殖、热应激、炎症及癌症等生物学过程,为探究畜禽m⁶A修饰参与复杂性状调控机制提供一定的借鉴意义。作者主要从m⁶A甲基化修饰相关蛋白（甲基转移酶、去甲基化酶及读取蛋白）、m⁶A检测技术、m⁶A对哺乳动物复杂性状的调控机制、m⁶A与其他表观修饰的互作机制等方面进行阐述,为m⁶A在畜禽遗传育种中的应用提供新的见解。     

猪TLR5基因表达水平与F18大肠杆菌侵染关系分析

为了探究猪Toll样受体（Toll-like receptor 5,TLR5） 基因表达水平与F18大肠杆菌抗性的关系,试验通过不同血清型产肠毒素大肠杆菌（F18ab和F18ac）侵染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,同时通过脂多糖（LPS）分别诱导IPEC-J2细胞4和8 h,利用实时荧光定量PCR检测TLR5基因表达水平变化,并利用Western blotting进行蛋白表达分析。结果显示,不同血清型大肠杆菌（F18ab和F18ac）菌体侵染IPEC-J2细胞后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）;LPS诱导IPEC-J2细胞4和8 h后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）,且在LPS诱导IPEC-J2细胞8 h后,TLR5基因表达水平明显高于诱导4 h。与对照组相比,细胞中TLR5蛋白的表达水平极显著上调（P<0.01）,与LPS诱导及F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后mRNA表达水平结果相一致。本研究在细胞水平上分析了TLR5表达水平和F18大肠杆菌侵染的相关性,进一步证实猪TLR5基因的表达水平在细胞抵抗F18大肠杆菌的侵染过程中发挥了重要的调控作用,为今后关于TLR5基因功能及其在大肠杆菌腹泻遗传育种应用的研究奠定基础。     

苏太猪抗F18+大肠杆菌病基础群FUT1基因多态性及其与生长发育的关联分析

本研究采用PCR-RFLP方法对苏太猪F18+大肠杆菌抗病育种基础群α-(1,2)岩藻糖转移酶基因1（FUT1）M307位点多态性进行了分析,并探讨了其与部分生长发育性能的相关性。苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群FUT1基因M307位点经Hin6Ⅰ酶切后,产生AA、AG和GG 3种基因型,频率分别为0.235、0.609和0.156,群体极显著的偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。总体上AA基因型的个体生长发育优于AG和GG基因型的个体,其中AA基因型个体的60 kg体长显著高于AG和GG基因型的个体(P<0.05),断奶重显著高于GG基因型的个体(P<0.05),体高和后躯宽显著高于AG基因型的个体(P<0.05)。试验结果表明,苏太猪抗病育种基础群中FUT1基因第307位点的AA基因型不仅对仔猪断奶后水肿病和腹泻病具有抗性,而且具有较高的早期生长发育性能。     

猪圆环病毒2型Cap 蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a( )中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

苏太猪抗F18+大肠杆菌病基础群FUT1基因多态性及其与生长发育的关联分析

本研究采用PCR-RFLP方法对苏太猪F18+大肠杆菌抗病育种基础群α-(1,2)岩藻糖转移酶基因1（FUT1）M307位点多态性进行了分析,并探讨了其与部分生长发育性能的相关性。苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群FUT1基因M307位点经Hin6Ⅰ酶切后,产生AA、AG和GG 3种基因型,频率分别为0.235、0.609和0.156,群体极显著的偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。总体上AA基因型的个体生长发育优于AG和GG基因型的个体,其中AA基因型个体的60 kg体长显著高于AG和GG基因型的个体(P<0.05),断奶重显著高于GG基因型的个体(P<0.05),体高和后躯宽显著高于AG基因型的个体(P<0.05)。试验结果表明,苏太猪抗病育种基础群中FUT1基因第307位点的AA基因型不仅对仔猪断奶后水肿病和腹泻病具有抗性,而且具有较高的早期生长发育性能。     

Relationship Between Expression Levels of Porcine m6A Demethylases FTO and ALKBH5 Genes and Resistance to E.coli F18 Infection

To investigate the relationship between the mRNA expression level of m⁶A demethylase and E.coli F18 resistance in piglets,Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression differences of m⁶A demethylase FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum tissues of E.coli F18-resistant and -sensitive individuals from 35-day Sutai weaned piglets.In E.coli F18ab,F18ac bacteria-stimulated and endotoxin LPS-induced porcine small intestinal epithelial cells (IPEC-J2),the expression levels of FTO and ALKBH5 genes were detected,respectively.The results showed that the expression levels of FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum of resistant individuals were extremely significantly or significantly higher than those of sensitive individuals (P<0.01,P<0.05),and the expression of FTO gene were not significantly changed in E.coli F18 bacteria-stimulated IPEC-J2 cells (P>0.05),but the expression levels of ALKBH5 gene were significantly up-regulated after F18ac stimulation (P<0.05).After LPS induction for 4 hours,the expression levels of FTO and ALKBH5 genes showed significant up-regulation in IPEC-J2 cells (P<0.05).This study preliminarily verified and indicated that the expression levels of m⁶A demethylases FTO and ALKBH5 genes were closely related to E.coli resistance of piglets at the cellular and individual levels,which will provide a theoretical basis for future in-depth study of the regulation mechanism of RNA demethylation modification on bacterial diarrhea in piglets.     

m6A甲基化酶METTL3和WTAP在牦牛组织及脂肪细胞中的表达

本研究旨在探究m⁶A RNA甲基化酶METTL3和WTAP在牦牛(Bos grunniens)不同组织、前体脂肪细胞增殖与分化过程中的表达模式和前体脂肪细胞分化过程mRNA m⁶A的变化水平。采用qRT-PCR检测牦牛皮下脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、肾和皮下脂肪不同时期(18和30月龄)METTL3及WTAP的mRNA表达水平。应用I型胶原酶消化法获取牦牛前体脂肪细胞,油红O染色和脂肪分化标志基因的检测建立牦牛前体脂肪细胞分化模型,以及qRTPCR检测前体脂肪细胞增殖分化阶段METTL3和WTAP的mRNA表达水平。结果表明,肝脏组织中METTL3表达最高(P<0.05),皮下脂肪组织表达量最低(P<0.05);WTAP在皮下脂肪组织中的表达最为丰富,脾脏中的表达量最低(P<0.05)。30月龄皮下脂肪组织中METTL3和WTAP mRNA表达量高于18月龄。前体脂肪细胞诱导分化12 d时,细胞中出现多而密的脂环,脂肪细胞分化特异性标志基因FABP4、C/EBPα和PPARγ第12天的表达量显著高于第0天(P<0.05)。METTL3和WTAP的表达量在细胞增殖阶段(24、48和72 h)呈现“下降-上升”的表达趋势(P<0.05)。在牦牛前体脂肪细胞分化阶段(0、4、8和12 d),METTL3表达量呈现“上升-下降-上升”的趋势,WTAP呈现“上升-下降”的趋势。细胞分化阶段mRNA m⁶A水平呈现逐渐上升的趋势,在分化12 d时细胞内RNA的m⁶A丰度最高(P<0.05)。本研究获得METTL3和WTAP在牦牛不同组织和前体脂肪细胞增殖分化阶段的变化规律及细胞分化过程中mRNA m⁶A水平变化,初步揭示WTAP和METTL3对牦牛脂代谢具有重要的调控作用。     

iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析

对20株鸡源大肠杆菌的致病性进行测定。并对不同致病性鸡大肠杆菌的iss基因进行了扩增。结果表明：鸡E．coli O1、O2、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E10、E11、E27对1日龄雏鸡具有较强的毒力;O78、E5、E21的致病性较弱;而E．coli E1、E4、E7、E8、E9、E14、E18接种雏鸡均无死亡。iss基因在致病性鸡E．coli O1、O2、O78、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E5、E21、E10、E11、E27中的扩增频率为92．31％;在毒力较强的致病性鸡Ecoli O1、O2、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E10、E11、E27中的扩增频率为100％;在无致病性(或低毒力)的鸡Ecoli E1、E4、E7、E8、E9、E14、E18中的扩增频率为14．29％。结果表明：iss基因在致病力强的菌株中的扩增频率明显高于其它菌株,iss基因的存在与鸡大肠杆菌的毒力问有一定的相关性。     

大肠杆菌新型菌毛(F1987)基因文库的构建

用碱裂解法从表达新型菌毛 (F1987)的 E.coli DH5 α阳性转化子中提取相应质粒 DNA,用 Bam H 对相应质粒和载体质粒 (p U C19)分别进行酶切 ,酶切产物经过纯化并按一定比例混合后 ,加入 T4 DNA连接酶进行连接 ,连接产物用热激法转化受体菌 E.coli DH5 α,构建了相应的基因文库。     

禽大肠杆菌高密度发酵与溶氧关系的研究

利用GUJS—10C小型发酵罐分批培养禽大肠杆菌，通过平板计数、比浊计数的方法，对大肠杆菌高密度发酵中细菌生长与溶氧的关系进行分析。结果表明：溶氧的规律性变化能够反映大肠杆菌生长的规律，即在细菌生长的适应期细菌数量较少，耗氧量少，溶氧曲线最高；随着发酵时间的增加，细菌不断增多，耗氧量也随之增加，溶氧曲线下降；达到对数生长期，曲线最低；进入稳定期，曲线趋于平稳；到发酵后期，细菌进入衰老期，溶氧曲线略有上升，这时可终止发酵。     

m6A甲基化在鸡肌肉生长发育中的表达研究

试验旨在研究RNA m6A修饰相关基因去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5,ALKBH5）、去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3,METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14,METTL14）和成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein,WTAP）在鸡骨骼肌发育过程中的表达,分析其与骨骼肌m6A甲基化水平的相关性。首先,利用实时荧光定量PCR技术检测m6A甲基化相关基因在金茅花鸡12（E12）、14（E14）、16（E16）、18（E18）胚龄和1日龄腿肌和胸肌组织中mRNA表达水平,以及其在鸡成肌细胞50%、100%增殖期和1、2、3、4、5 d分化期的mRNA表达水平;随后,利用m6A甲基化试剂盒检测金茅花鸡E12和1日龄腿肌和胸肌组织中m6A甲基化修饰水平,与m6A甲基化相关基因表达水平进行相关性分析。结果显示,m6A去甲基化基因ALKBH5和FTO mRNA表达水平在骨骼肌发育过程中显著上调（P<0.05）,即在E12、E14低表达,E16、E18逐渐上调,1日龄达到最高。m6A甲基化写入基因METTL14、METTL3和WTAP mRNA表达水平在E12、E14、E16逐渐上升,E18下降,随后至1日龄表达量回升。在细胞增殖过程中,ALKBH5、FTO、METTL14、METTL3和WTAP基因表达均上调;在细胞分化过程中ALKBH5和FTO基因表达水平显著上调（P<0.05）,在分化第5天达到最高。METTL14、METTL3和WTAP基因mRNA表达水平在细胞诱导分化的1、2、3、4 d表达量呈下降趋势,而在诱导分化的第5天有所回升。甲基化水平检测结果显示,腿肌和胸肌m6A甲基化水平变化趋势一致,均在胚胎发育过程中显著下降（P<0.05）,至1日龄达到最低。相关性分析结果显示,鸡骨骼肌RNA m6A甲基化水平与m6A去甲基化修饰基因ALKBH5、FTO mRNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。综合以上试验结果,推测m6A甲基化修饰与鸡骨骼肌发育相关,而去甲基化基因ALKBH5、FTO可能通过调控RNA m6A甲基化水平,影响鸡骨骼肌发育。本研究结果为进一步研究m6A甲基化修饰调控鸡骨骼肌生长发育的功能和分子机制提供理论依据。     

土鸡屠宰过程中大肠杆菌毒力基因检测及耐药性分析

为了解土鸡屠宰过程中大肠杆菌污染、毒力基因携带及耐药情况,2018年9月-2019年1月在重庆万州、开州、巫溪、奉节4个区县的12个土鸡屠宰地点采集了319份样品,通过菌落形态及显微镜观察、生化鉴定、PCR、药敏试验等方法鉴定分离的大肠杆菌,检测其毒力基因携带和耐药性情况。结果表明：大肠杆菌分离率为22.57%（72/319）,其中餐馆、活禽宰杀铺和定点屠宰点分离率依次为29.73%（22/74）、25.00%（24/96）和17.45%（26/149）,污水、地面、羽毛、用具和胴体分离率依次为75.00%（18/24）、21.62%（8/37）、20.54%（23/112）、17.65%（6/34）和15.18%（17/112）;11种毒力基因中除estA、estB、elt外均被检出,检出率为58.33%（42/72）,共检出14种组合型,有4株分离株4种毒力基因同时存在;分离株对阿米卡星、头孢噻肟最敏感,多重耐药比为90.28%（65/72）,以7~10重耐药居多。土鸡屠宰过程中致病性大肠杆菌污染风险高,多重耐药现象严重,应重视养殖合理用药及屠宰卫生环境。