盖塔病毒E2蛋白的单氨基酸多态性影响病毒毒力新发现

盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种由蚊媒传播的单股正链RNA病毒,属于披膜病毒科甲病毒属.该病毒自1955年在马来西亚分离至今,已遍布欧亚大陆和东南亚,1964年在中国南部的海南省首次发现GETV,迅速蔓延,近年来我国报道已有超过15个省份出现动物盖塔病毒疫情,造成一定的经济损失.该病毒宿主范围广,在猪...     

蠓虫源盖塔病毒(SZC30)结构基因分子生物学特征分析

为了解云南蠓虫源盖塔病毒（GETV） SZC30株分子特征及其与国内外其他媒介和宿主动物中分离病毒的遗传进化关系,本研究采用5对盖塔病毒特异引物对2013年首次在云南省蠓虫中分离的盖塔病毒SZC30株结构基因进行RT-PCR扩增,并对扩增产物进行测序;采用DNAStar软件中SeqMan进行序列拼接,获得SZC30株病毒结构基因序列长3 762 nt,编码衣壳蛋白（C）、E1、E2、E3和6K蛋白,序列长度分别为804、1 317、1 266、192和183 nt,编码蛋白长度分别为268、438、422、64和61个氨基酸。C、E1和E2基因系统进化分析显示,SZC30株与1955-2018年不同地域、宿主分离的27株盖塔病毒分离株形成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个进化分支;SZC30株与中国、韩国和日本蚊虫和动物分离株位于Ⅲ进化分支内,核苷酸同源性最高,在98.0%以上,氨基酸同源性在98.9%以上,亲缘关系较近;而与马来西亚、俄罗斯等蚊虫分离株位于不同进化分支,核苷酸同源性低于97.6%,亲缘关系较远;与马来西亚蚊虫分离株（GenBank登录号：AF339484）、中国海南和云南蚊虫分离株（GenBank登录号：EU015061和KY434327）在C、E1和E2蛋白存在31个氨基酸差异位点,而与日本蚊虫分离株（GenBank登录号：LC152056）、中国猪分离株（GenBank登录号：MG865966和MG865969）氨基酸位点无差异,且同源性为100%。SZC30株与27株盖塔病毒在E1、E2蛋白上存在2个潜在糖基化位点和3个跨膜区;T细胞抗原表位分析结果显示,SZC30株与分离自蚊、猪、狐、牛和马等的盖塔病毒分离株均存在表位差异,其中,E1、E2蛋白发现较多表位差异。以上结果提示,蠓虫源盖塔病毒与大多数蚊虫和动物分离毒株同源性高、遗传进化关系近,且氨基酸位点、糖基化位点、跨膜区结构等分子特征相似,提示蠓虫可能作为一种潜在的传播媒介参与了当地盖塔病毒的传播扩散。     

一例猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖塔病毒混合感染的诊断

正盖塔病毒(Getah virus, GETV)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员~([1])。1995年Scherer等首次在马来西亚橡胶林中生存的白雪库蚊(Culex gelidus)中分离得到该病毒~([2])。GETV可感染多种动物并引起马和猪发病。2017年湖南省暴发GETV猪群感染导致大量母猪流产和仔猪死亡,同年10月周峰等首次报道中国河南省某猪场的猪感染盖塔病毒~([3]),这种病毒对10日龄内仔猪有致病性,     

上海地区猪场蚊源乙型脑炎病毒MH-7和PD-19的分离鉴定及分子特征分析

为了解上海地区猪场蚊媒携带乙型脑炎病毒(JEV)的流行情况,本研究对2014年上海地区猪场采集的4 000只蚊媒样品进行了病毒分离、RT-PCR及间接免疫荧光鉴定。结果表明,分别从三带喙库蚊和中华按蚊中分离到两株JEV,命名为MH-7株和PD-19株。E基因序列分析显示MH-7株属于基因Ⅰ型,PD-19株属于基因Ⅲ型。与减毒活疫苗株SA-14-14-2株E基因核苷酸和编码氨基酸比较结果显示,MH-7株的同源性分别为87.4%和97.2%;PD-19株为98.1%和97.2%。将两株分离株分别接种3日龄乳鼠,均可在72 h之内致乳鼠死亡,表明它们均具有较强的神经毒力。本研究为上海当地制定JEV防制方案提供了实验依据。     

新疆库蠓源性盖塔病毒的分离与鉴定

为了解新疆尉犁县库蠓体内携带病毒情况,从该县采集18 000只库蠓,50只为一组研磨后分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞,盲传5代,一组样品使BHK-21出现CPE,先用5-氟尿核苷药敏试验鉴定为RNA病毒,之后用虫媒RNA病毒引物扩增,鉴定为甲病毒,疑似盖塔病毒,最后用中和试验、免疫电镜观察和盖塔病毒C基因特异性引物PCR等方法鉴定分离毒株为盖塔病毒。本研究首次从新疆库蠓体内分离到盖塔病毒,该毒株与2005年日本分离株相似性高达98%,推测可能是由于引进日本带病种公畜或精液有关,提示在进出口畜牧贸易活动中,应加强盖塔病毒的检疫工作。     

盖塔病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测盖塔病毒(Getah virus,GETV)的核酸,并初步应用于GETV的临床标本检测。根据GenBank登录的GETV全基因组序列,应用生物学软件进行序列比对,在NSP1保守区设计1对特异性引物和TaqMan探针。建立实时荧光定量RT-PCR检测GETV的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法能特异性地鉴别检测GETV;检测灵敏度高,检测的最低模板量可以达到2.03×10~1 copies/μL;将收集到的10 000只蚊子样品分成100份进行检测,共检测出8份GETV阳性样品,与常规反转录PCR(RT-PCR)检测及病毒分离结果吻合。本研究建立的GETV TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于GETV的临床早期诊断。     

猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的Taq Man实时荧光定量PCR方法。结果表明：以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10²～1×10⁷ copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID₅₀/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10³ TCID₅₀/m L;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。     

盖他病毒E2蛋白的表达纯化以及抗原性鉴定

参考Gen Bank(EU015066)盖他病毒(Getah virus,GETV)SH05-6中结构蛋白E2的全基因序列并对其进行密码子优化。将优化后的基因片段克隆至原核表达载体p ColdⅠ中,构建重组表达载体p Cold-E2。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG低温诱导后,SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,在相对分子质量46 k Da处出现目的条带,与预期相符,且占大肠杆菌表达蛋白总量的80%。结果证明E2基因在大肠杆菌中获得了高效表达,并且能与抗血清发生特异性反应。本研究为GETV快速检测方法的建立和GETV流行病学调查奠定了基础。     

猪源盖塔病毒的分子生物学研究进展

盖塔病毒(GETV)属于披膜病毒科甲病毒属.GETV属于虫媒病毒,可以通过蚊虫感染低等脊椎动物.猪群感染GETV后可发生轻微症状,主要导致怀孕母猪繁殖障碍.目前,GETV在世界范围内流行较为广泛,近年来逐步在猪群中暴发,导致部分猪场经济损失严重.因此,加强对猪源GETV的病原、致病机制和疫苗的研究,对于该病的防控具有更...     

绵羊伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gD基因序列分析

本研究以1例疑似绵羊伪狂犬病病例为研究对象,进行了病毒分离鉴定及其g D基因分析。将病料接种BHK-21细胞,细胞出现病变,经间接免疫荧光和荧光定量PCR检测结果证实,所分离的病毒为伪狂犬病病毒,将其命名为SH1311毒株。在电镜下观察病毒,病毒粒子呈球形,囊膜表面有大量纤突。对分离株g D基因进行PCR扩增、测序和序列分析,并与国内外伪狂犬病病毒株的同源性进行比较发现,该分离株与2012年以来上海市分离的猪PRV毒株g D基因的同源性最高,为99.8%~100%,而与2010年上海市流行毒株相比,同源性只有80.5%。构建的g D基因进化树显示,SH1311分离株与上海市2012~2015年间分离的7株猪伪狂犬病病毒以及国内JS-2012、HNB、HN1201、HLJ8、BJ/RD、ZJ01毒株属于同一个进化分支,亲缘关系最近,与欧美以及韩国的流行毒株都处在不同的分支上。     

鸽源冠状病毒PSH中国分离株S1基因克隆及分子进化分析

对分离鉴定的鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析.结果表明其S1基因由1 626个核苷酸组成,编码541个氨基酸,S蛋白的切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR）,与常见的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白切割识别位点相似（RRF/SRR）.该病毒与火鸡蓝冠病病毒（TCV）Gh、G1株S1基因推导的氨基酸同源性仅为24.7%、25%,而与IBV H52、H120、M41、Beau、Conn、Gray、Hotel、SH1、SH2、SH5、SH6基因推导的氨基酸同源性在75.0%～99.6%,其中与SH2、SH5的氨基酸同源性更是达到了99.6%,进一步证明该冠状病毒可能来源于IBV.     

盖塔病毒感染流行病学与防控研究进展

盖塔病毒（Getah virus,GETV）是一种经蚊虫传播、可感染人和多种动物并导致全身症状的人兽共患传染病病原。目前全球已有13个国家分离到GETV，我国已在22个省份分离到该病毒；其地理分布范围逐渐从热带地区传播到温带地区，甚至寒冷的北极地区；能够携带和传播GETV的吸血昆虫种类也在大幅增加。流行病学调查显示，GETV可感染包括猪、马等家畜在内的至少十几种动物，从人群中也检测到了GETV抗体阳性，但还没有人感染GETV后患病的相关报告。随着全球气候变化、动物迁徙以及国际交流频繁，GETV流行范围还可能继续扩大，对养猪业发展构成潜在威胁的同时，其感染人的风险也在加剧。近年来，国内外针对GETV流行范围、传播媒介、易感动物以及感染病例等方面的研究不断增多。本文对GETV的感染病例分布、分子遗传进化规律、传播途径和引发疫病暴发特点等方面的国内外研究情况进行综述，以引起兽医相关部门和公共卫生机构对GETV经济危害和潜在公共卫生威胁的重视，并为GETV的研究和防控提供参考。     

6株H9N2禽流感病毒分子进化及对小鼠的致病性

2009年从山东不同地区的规模化肉鸡场中分离到6株H9N2亚型流感病毒,对其分子特征进行分析,发现6株病毒可以分为2个不同的基因型,并且其中一个基因型是CK/SH/F/98（H9N2）和CK/SH/Y2/2008（H9N2）的重组病毒。为阐明H9N2流感病毒对哺乳动物致病性,分别以106 EID50剂量攻毒6周龄BALB/c雌性小鼠,6株病毒都能在小鼠肺脏中复制,而且2株病毒能在攻毒7d后引起小鼠死亡。结果表明,H9N2亚型流感病毒对哺乳动物毒力有增强趋势。     

盖塔病毒非结构蛋白NSP1多克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体，用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因，构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备了NSP1蛋白的多克隆抗体，间接ELISA效价达1∶10⁵以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示，NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备，为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。     

猪源盖塔病毒Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体的制备及其免疫特性分析

采用RT-PCR技术扩增猪源盖塔病毒(Getah virus, GETV)的衣壳蛋白(Cap)与糖蛋白(E2)基因,构建了Cap与E2蛋白的原核表达载体pET-Cap和pET-E2,转化至BL21(DE3)诱导大量表达。纯化并复性原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了Cap蛋白和E2蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10~5以上。Western blot和免疫荧光(IFA)结果显示,Cap蛋白和E2蛋白多抗与GETV均有良好的反应性。本研究制备的Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体,为建立ELISA等检测方法以及GETV致病机制的研究提供了参考。     

主要动物蚊媒病的流行概况及传入我国的风险分析

蚊是传播乙型脑炎病毒、赤羽病病毒、西尼罗病毒、水泡性口炎病毒、基孔肯雅热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、裂谷热病毒等动物虫媒病毒的生物媒介。动物蚊媒病对畜牧业发展构成了严重威胁,造成巨大的经济损失。本文整理汇总了主要动物蚊媒病的流行状况及其相关传播媒介蚊科的种类,并对未传入我国潜在的动物蚊媒病进行了风险分析,为我国动物蚊媒病的进一步研究和预防控制提供理论依据。     

盖他病毒简介及日本盖他病毒病的发生情况

盖他病毒(Getah virus,简称GETV)是属于披盖病毒科甲病毒属的一种虫媒病毒。本病毒于1956年首次在马来西亚从蚊体内分离到,此后,在日本(1959年)及澳大利亚(1963年)也相继分离到此病毒。日本是于1959年首次从群马县的猪血液中分离到此病毒的,分离到此病毒时,关于此病毒对猪的病原性等不太清楚。1966年Doherty氏和     

水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

本试验从疑似细小病毒感染的病死水貂中分离到1株病毒。经PCR鉴定、细胞培养、蛋白质电泳鉴定最终确定为水貂肠炎细小病毒(MEV),命名为MEV-WFD。对该分离病毒的衣壳蛋白VP2基因进行克隆测序分析,结果表明此病毒VP2基因3处碱基发生点突变,其中一处的突变导致第328处氨基酸残基由疏水性丙氨酸(Ala)变为亲水性苏氨酸(Thr)。将此株病毒VP2基因与GenBank上公布的所有MEV的VP2基因碱基序列进行同源性比较及进化树分析,结果表明该病毒与ZYL-1、MEV/LN/-10和Manzhouli的VP2基因同源率最高,为99.8%;进化树构建结果表明,该病毒与6株已公布的病毒属于同一进化分支。     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

一株普通鵟源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从深圳野生鸟类救护基地的1只普通鵟的泄殖腔拭子中分离到1株禽流感病毒,将该禽流感病毒进行鸡胚接种和HA、HI试验鉴定、HA基因扩增及测序分析,并进行致病性试验。结果表明,该分离株为H9N2亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)。进化分析显示,该毒株属于4.2.1分支,与SS/94株同源性较低,与A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遗传距离最近。同时以血凝价HA 8log2病毒尿囊液稀释200倍静脉注射接种感染4周SPF鸡,感染3d后从心、肝、肺、肾、气管、咽及肛分别检测到病毒,感染7d后从心、肝、肺、肾、气管均未分离到病毒,咽部病毒分离率2/6,肛部病毒分离率3/6。