1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限.本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起...     

1株库蠓源版纳病毒的分离与全基因组序列分析

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建。结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株（YNSZ043）,病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70~80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子。全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒（Banna virus,BAV）,基因组大小为20 683 bp,由Seg-1（3 762 bp）至Seg-12（861 bp）12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8%~99.6%之间,氨基酸序列相似性在58.8%~100%之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系。对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1%和97.6%,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配。研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考。     

从原野库蠓中分离到一株RNA病毒

１９９２年９月从安徽省某地黄牛体表采集的原野库蠓雌虫经细胞培养连续传代代分离到一株病毒。初步试验结果表明该分离毒株无囊膜，呈球形，大小约为２４－２５ｎｍ。分离株的最适培养温度为３７℃，对Ｖｅｒｏ细胞系，Ｃ６／３６细胞系的敏感性无明显差异。药物制试验结果证明该分离毒株为ＲＮＡ病毒。分离病毒能引起１－２日龄乳鼠发病和死亡。     

从原野库蠓中分离到一株RNA病毒

1992年9月从安徽省某地黄牛体表采集的原野库蠓雌虫经细胞培养连续传代分离到一株病毒。初步试验结果表明该分离毒株无囊膜，呈球形，大小约为24～25nm。分离株的最适培养温度为37℃，对Vero细胞系、C6／36细胞系的敏感性无明显差异。药物抑制试验结果证明该分离毒林为RNA病毒。分离病毒能引起1－2日龄乳鼠发病和死亡。     

云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5~10月,每周采血1次,11~12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性,至11月,监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2~13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚,收获鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。采用RT-PCR方法,针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物,扩增其相应片段。结果显示,共分离到86份疑似分离物,其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增,均扩增出1156 bp片段,初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验,67份毒株为蓝舌病病毒,与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现,BTV-1株序列与同型Y863(登录号:KC879616)参考毒株的同源性为92%,BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株,分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。     

新疆库蠓源性盖塔病毒的分离与鉴定

为了解新疆尉犁县库蠓体内携带病毒情况,从该县采集18 000只库蠓,50只为一组研磨后分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞,盲传5代,一组样品使BHK-21出现CPE,先用5-氟尿核苷药敏试验鉴定为RNA病毒,之后用虫媒RNA病毒引物扩增,鉴定为甲病毒,疑似盖塔病毒,最后用中和试验、免疫电镜观察和盖塔病毒C基因特异性引物PCR等方法鉴定分离毒株为盖塔病毒。本研究首次从新疆库蠓体内分离到盖塔病毒,该毒株与2005年日本分离株相似性高达98%,推测可能是由于引进日本带病种公畜或精液有关,提示在进出口畜牧贸易活动中,应加强盖塔病毒的检疫工作。     

1株新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

山东某鸭场疑似发生新型鸭呼肠孤病,从采集的病料组织样品中分离出1株病毒,经一步法RT-PCR扩增得到新型鸭呼肠孤病毒部分S3基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的新型鸭呼肠孤病毒同源性为100%,并对鸭具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株新型鸭呼肠孤病毒山东地方流行毒株。     

云南省2株鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了监测云南省反刍动物鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)的感染情况,本试验在云南省师宗县设立了监控点,筛选出EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,每年的5～10月份每周采血1次,11月到次年4月份每月采血1次,通过酶联免疫吸附试验监测其抗体转阳情况,用转阳牛的红细胞接种BHK以分离病毒,用病毒RT-PCR和中和试验鉴定病毒。结果显示,从2头转阳牛的抗凝血中分离到2株EHDV,其TCID₅₀分别为10^-2.5/0.1 mL和10^-3.44/0.1 mL,血清型均为EHDV-5型。本试验在云南省分离到EHDV,明确了云南省反刍动物存在EHDV感染,为我国监控EHDV流行情况及疫病风险防范提供了重要借鉴意义。     

蓝舌病毒RT-PCR检测方法的建立及对云南省库蠓蓝舌病流行病学检测

建立蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病(BT)流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱市澜沧县的BT传播媒介库蠓共25万余只,进行研磨后,用建立的RT-PCR方法检测样本。筛选出1对引物BTVS10-F和BTVS10-R作为蓝舌病毒RT-PCR检测引物,敏感度达到10~(2.5) TCID_(50)/0.1 mL,通过对BTV16型的阳性病毒检测,证实该方法的可行性。     

1株鹅细小病毒的分离鉴定

2004年3月以来，辽宁省部分地区雏鹅，出现下痢、口吐黏液、采食量减少等症状，个别鹅出现转脖、抽搐的情况。发病后的前4天曾经用过庆大霉素治疗，但没有效果。发病鹅表现为下痢、采食量减少，没有出现神经症状。肠浆膜呈橘黄色，小肠中后段膨大增粗，肠壁变薄，没有凝固性栓子。肝脏肿大，胆囊明显膨大，心肌颜色变淡，肾脏肿胀。为查明原因，笔者对发病的雏鹅进行病毒的分离与鉴定工作，通过电镜观察、琼脂扩散试验、病毒中和试验、抗血清保护试验，证实获得1株鹅细小病毒。经鹅胚接种、雏鹅攻毒试验，证实所分离的病毒具有较强的致病性。     

新型鹅星状病毒现地株的分离鉴定

为了解齐齐哈尔地区新型鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GAstV）的流行情况,本试验采用从查哈阳农场某养殖场采集的疑似新型鹅星状病毒感染致死的雏鹅肝脾病料,进行病毒分离培养,对获得的病毒尿囊液进行RT-PCR检测、病毒半数致死量测定、血凝性检测及动物回归试验。结果表明：分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;测定病毒的半数致死量（EID50）为10～3.5;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅发病死亡;ORF1b基因R T-PCR扩增条带大约为210 bp,与目的条带大小相符;对其进行核苷酸序列比对,与在NCBI上已发表的新型鹅星状病毒核苷酸同源性高达99.64%。说明该分离株为新型鹅星状病毒毒株。     

兔病毒性出血症病毒西藏分离株毒力的测定

对一株兔病毒性出血症病毒(RHDV)西藏株进行血凝性、特异性、致病性及毒力鉴定。结果表明:此株RHDV血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;RHDV的最小致死量为10-5/mL。说明此分离株是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

兔出血症病毒西藏野毒分离株的鉴定

对西藏农牧学院分离的一株兔出血症病毒(RHDV)西藏野毒进行血凝性、特异性和致病性进行鉴定。结果表明,此株RHDV野毒血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;西藏株RHDV的最小致死量为10^-5／mL,是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

一株麻鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定

近几年,鸡传染性法氏囊病毒新型变异株在我国广泛流行,主要发生于肉鸡,其致病力弱、隐蔽性强但能造成法氏囊严重萎缩。本研究从山东济宁地区临床出现法氏囊萎缩的发病麻鸡中采集法氏囊病料,接种SPF鸡胚进行病毒分离,通过RT-PCR方法进行病毒鉴定,将分离毒株回归SPF鸡进行致病性试验,同时对其主要抗原基因VP2进行进化分析。结果发现,该毒株能致死鸡胚;对其VP2基因进行测序比对和进化树分析发现,其与近几年的新型变异株基因序列的进化关系较近,同源性为96.1%～99.2%;人工感染SPF鸡第7 d法氏囊即出现较为明显的萎缩,第14 d萎缩更为明显,囊体比显著小于对照组(P<0.01)。本研究分离到的麻鸡源传染性法氏囊病毒JN22株属于新型变异株,能导致SPF鸡法氏囊显著萎缩。     

新型鸭源细小病毒安徽株AH-D15株的分离鉴定

为确定安徽省某鸭场发生的以雏鸭发育迟缓、鸭喙萎缩、舌头外伸下弯为特征的疾病病因,本研究利用PCR对病鸭样品进行检测,结果扩增出鹅细小病毒(GPV)特异性目的片段。将PCR阳性病料组织样品接种11日龄樱桃谷鸭胚,盲传3代后,可致鸭胚胚体出血严重,并且鸭喙畸形,证实分离到一株鸭源细小病毒(命名为AH-D15株)。利用第3代尿囊液感染2日龄健康樱桃谷肉鸭,2周后感染鸭出现短喙症状,并从鸭脑、肾、脾、胰腺和肝脏组织内检测到病毒。将分离病毒株的VP3核苷酸序列与Gen Bank中登录的GPV和番鸭细小病毒进行比对,结果表明AH-D15株与德国的VG32/1株和匈牙利的virulent B株亲缘关系最近,同源性分别为96.3%和96.5%。上述结果表明从病鸭体内分离到的鸭细小病毒可能来源于GPV,因此为该病的防控提供实验依据。     

一株H1N1病毒的分离鉴定

研究样本来自黑龙江省绥化市的一个生猪养殖场,分别采集疑似发生猪流感的病猪鼻拭子样本和濒死猪的肺组织样本,处理后接种到10日龄的SPF鸡胚中,分离出一株具有血凝性的病毒。采用血清学、RT-PCR、电镜、生物学特性及理化特性测定等方法对病毒进行鉴定,结果显示分离株的鸡红细胞的凝集价为1:256,只能够中和H1亚型猪流感特异性阳性血清;RT-PCR结果为H1、N1亚型,电镜下的病毒粒子为球形,直径约80 nm,具有囊膜,同时表面有刺突和纤突,对鸡胚的半数感染量(EI D_(50))为10(-5.17)/0.1 mL;该病毒对热、胰蛋白酶、氯仿及乙醚均敏感;从以上病毒特性的研究,可以判定分离得到的病毒为H1N1亚型的猪流感病毒。     

西藏环状病毒RT-PCR检测方法的建立

建立西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)RT-PCR诊断方法。根据云南省新分离到的TIBOV Seg-7片段序列设计1套巢式引物为120S7F1/R1、120S7F2/R2。以TIBOV DH13C120株病毒核酸为模板,优化反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对云南省新分离的9株TIBOV进行核酸检测。分别采用外引物(120S7F1/R1)和内引物(120S7F2/R2)对TIBOV DH13C120株进行RT-PCR扩增,退火温度分别为52℃和54℃,外引物扩增出片段大小为1 050 bp条带;内引物扩增出的片段大小为500bp,扩增条带大小与设计预期相一致。而蓝舌病毒(BTV)JCC12-7株和阴性对照两轮扩增均为阴性,采用该方法对云南省新分离的9株TIBOV、2株BTV和1株鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,9株TIBOV扩增均为阳性,而BTV、EHDV和阴性对照均为阴性。建立了TIBOV巢式RT-PCR检测方法,该方法可用于云南省目前动物或媒介中流行的TIBOV核酸检测。