欧拉藏绵羊MSTN基因单碱基编辑体系的建立

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）基因突变时会导致肌纤维增粗,肌肉细胞增多,表现出双肌性状。为敲除欧拉藏绵羊MSTN基因以获得产肉性状更优的欧拉藏绵羊,利用胞嘧啶碱基编辑系统（CBE）在欧拉藏绵羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子。在MSTN基因3个外显子区域上各设计1条sgRNA,分别连接至pEF1a-BE4max-NG-mU6-gRNA-blast质粒并转染欧拉藏绵羊耳成纤维细胞,通过Sanger测序和T-A克隆检测,成功筛选出1条靶向外显子I的符合预期的sgRNA,编辑效率20%。本研究成功通过单碱基编辑技术在欧拉藏绵羊耳成纤维细胞MSTN基因编码区进行定点编辑,为通过分子育种培育产肉性状更佳的欧拉藏绵羊新品种奠定基础。     

利用单碱基编辑器定点突变猪肌肉生长抑制素基因的研究

【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。     

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD...     

单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展

单碱基编辑技术是以CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统为基础衍生出的能够对基因组进行精确定点编辑的一项新技术。与CRISPR/Cas9技术系统不同,单碱基编辑系统通过在双链造成单切口后对碱基进行单碱基的替换,有效解决CRISPR/Cas9基因编辑系统双链断裂易产生片段插入或者缺失的缺陷,提高单碱基编辑的精确性及效率。本文介绍了胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine BaseEditor）、腺嘌呤碱基编辑器（AdenineBaseEditor）以及最新的引导编辑系统（PrimeEditing）的建立过程、原理、优缺点及其在动物育种中的应用,并对单碱基编辑技术发展进行展望。     

单碱基编辑技术在动物中的应用

近年发展起来的人工核酸酶技术可引起特定位点的DNA双链断裂,断裂后通过同源重组修复机制使精准单碱基编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9将Cas9n与胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶融合而开发出的单碱基编辑系统可进一步提高单碱基编辑的效率和精确度,在不造成DNA双链断裂的情况下实现精准单碱基编辑。对动物进行单碱基编辑不仅有望提高其生产性能,而且能为人类疾病研究作出重要贡献。文章回顾了单碱基编辑系统的发展历程,重点介绍了单碱基编辑系统在动物中的应用,并对单碱基编辑系统在动物中的应用前景进行了展望,以期为动物基因编辑技术的研发和应用提供理论依据和应用案例。     

贵州香羊MSTN基因的多态性

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种在骨骼肌中广泛存在的糖蛋白,是骨骼肌生长的负调控因子,其基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增生与肌纤维肥大从而提高产肉力。采用PCR-RFLP方法对67只贵州香羊MSTN基因进行了多态性分析。结果显示,5′UTR和外显子1没有出现变异,内含子1和外显子2中存在BspLⅠ、XmnⅠ、BmrⅠ、Hpy188Ⅰ4个酶切多态位点。纯合野生型（AA、CC、EE、MM）为优势基因型,杂合型（AB、CD、EF、MN）和纯合突变型（BB、DD、FF、NN）为非优势基因型,A、C、E、M等位基因为优势基因。     

单碱基水平上胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的研究进展

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组（homology directed repair,HDR）仅仅发生在分裂活跃的细胞中,而非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）在整个细胞周期中都可以发生,因此,传统CRISPR/Cas9在单碱基分辨率上进行基因编辑时存在一定弊端。碱基编辑器（base editor,BE）的出现则在一定程度上弥补了这一缺陷。胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor,CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor,ABE）都能够在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换,极大地提高了单碱基编辑的应用价值。本文侧重对出现较早的CBE的原理、发展、应用及存在的问题进行综述,以期为高效单碱基突变工具在生物医学和畜牧业生产中的应用提供有益的参考和借鉴。     

MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量及其与生长指标相关性分析

试验旨在分析MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量及其与各项生长指标的相关性,为哈萨克羊的良种选育提供科学依据.随机选取5只哈萨克公羔羊,每月定时在羔羊活体腿部取肌肉组织,软尺测量体长、体高、体重、管围、胸围等各项生长指标.实时荧光定量 PCR分析1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中MSTN的表达量,相关性分析MSTN基因在羔羊肌肉中的表达量与各项生长指标的关联性.结果显示:哈萨克羔羊各项生长指标在1、2月龄快速增长,体重从4月龄开始增重缓慢,体长、体高、胸围在3月龄出现增长缓慢,管围在3月龄起基本停止增长.MSTN基因在1~4月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量均无显著性差异(P>0.05),呈现略微上升的趋势,5月龄达到最高峰,6月龄迅速下降.MSTN 基因在肌肉中表达量与体长呈显著负相关 (P<0.05),相关系数为-0.472,与体重、胸围呈弱负相关,与管围、体高呈弱正相关.     

哈萨克羊BMP15基因多态性研究

为了探索绵羊多胎性的分子机理以及为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据,采用PCR-RFLP及PCR-DS方法,对哈萨克羊群体BMP15基因FecXG和FecXB及第2外显子进行多态性检测.结果表明:BMP15基因FecXG和FecXB位点均未出现多态性,在第2外显子存在2种基因型,AA型和AB型;测序结果表明:AB型个体在该基因第775位点发生G→C的突变,出现G/C的杂合.优势基因型为AA型,优势等位基因为A基因,多态信息含量小于0.25,属于低度多态;χ2适合性检验表明:处于Hardy-weinberg平衡状态;显著性检验分析表明:该突变位点在不同产羔数母羊群体中的分布有一定的差异.该突变位点可以作为控制绵羊多胎产羔的潜在分子标记位点.     

新疆也木勒白羊肌肉生长抑制素基因在不同生长时期的表达研究

试验采用实时荧光定量PCR技术测定也木勒白羊肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因在不同生长时期(0～6月龄)的表达量,采用2^－ΔΔCt分析不同生长阶段表达量的差异,旨在掌握也木勒白羊不同生长时期MSTN基因的表达规律,为也木勒白羊肌肉生长性状的选育提供遗传学资料.结果发现,MSTN基因在3月龄也木勒白羊肌肉中的表达量显著低于其他月龄(P<0.05),其余各月龄差异不显著(P>0.05);MSTN在脂肪中的表达量0月龄相对较低,随月龄增长,表达量升高,在5月龄达到最高,后随月龄增长表达量降低.MSTN基因在肌肉和脂肪中的表达量随着月龄增长有一定的规律可循,其表达规律可为也木勒白羊肉用性能的选育提供一定的科学依据.     

新疆巴什拜羊肌肉生长抑制素基因DNA甲基化与mRNA表达量分析

为了探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因在肌肉和脂肪中的DNA甲基化模式及mRNA表达水平,试验以5月龄巴什拜羊羔羊为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测MSTN基因启动子区和第1外显子甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测MSTN基因在巴什拜羊股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂中的mRNA表达水平。结果显示,肌肉组织甲基化概率高于脂肪组织,其中,股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂的甲基化概率分别为74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%,MSTN基因在股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌中的表达水平显著低于尾脂（P < 0.05）,股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌之间差异不显著（P > 0.05）,巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因DNA甲基化水平与MSTN基因表达量呈显著负相关（r=－0.886,P < 0.05）。     

Analysis of DNA Methylation and mRNA Expression Level of MSTN Gene in Xinjiang Bashiby Sheep

In order to investigate DNA methylation and expression levels of myostatin (MSTN) gene in mscule and fat, 5 months of age of Bashiby sheep were selected, the promoter region and exon 1 methylation levels of MSTN gene was analyzed using bisulfite sequencing PCR (BSP). Real-time PCR was used to detect the expression level of MSTN gene in biceps femoris, femoral triceps, semitendinosus, semimembranosus, longissimus dorsi muscle and tail fat of Bashiby sheep. The results showed that the methylation probability of muscle was higher than fat, the methylation probability of biceps femoris, femoral triceps, semitendinosus, semimembranosus, longissimus dorsi muscle and tail fat were 74.2%, 74.2%, 83.2%, 83.7%, 82.1% and 25.3%, respectively. The expression levels of MSTN gene in biceps femoris, femoral triceps, semitendinosus, semimembranosus, longissimus dorsi muscle were significantly lower than tail fat in Bashiby sheep (P < 0.05), but there were no significant difference among biceps femoris, femoral triceps, semitendinosus, semimembranosus and longissimus dorsi muscle (P > 0.05).The DNA methylation was negatively correlated with the expression levels in muscle and fat of Bashiby sheep (r=-0.886, P < 0.05).     

哈萨克羊iNOS基因多态性与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在探讨哈萨克羊诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因多态性与布鲁氏菌病的相关性。使用虎红平板凝集试验（RBPT）方法对231只哈萨克羊血清进行布鲁氏菌病血清学检测,参考GenBank中绵羊iNOS基因序列,针对其第6、7、8外显子及其邻近内含子片段设计引物,利用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对231只哈萨克羊的iNOS基因进行多态性检测,分析其SNPs与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。结果表明,67只哈萨克羊为布鲁氏菌感染阳性,阳性检出率为29.00%。在哈萨克羊iNOS基因的外显子6和8片段上未检测到多态位点,在外显子7片段上检测出F7-T18054C和F7-C18084T 2个多态位点,在F7-T18054C多态位点上检测到3种基因型（TC、TT、CC）,优势等位基因和基因型分别是C型和CT型,其等位基因频率和基因型频率分别是0.660和0.446。在F7-C18084T多态位点上检测到2种基因型（CT、CC）,优势等位基因频率和基因型分别是C和CC型,其等位基因和基因型频率分别是0.946和0.892。F7-C18084T属于低度多态（PIC<0.25）,F7-T18054C属于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。相关性分析表明,F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性无显著相关性（P>0.05）。试验结果表明,哈萨克羊iNOS基因F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性不存在相关性。     

澳洲白绵羊美丽臀和肌肉生长抑制素基因基因型的检测

美丽臀(callipyge,CLPG)及肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是全世界公认的与肌肉生长发育相关的基因,突变后分别产生“美丽臀”和“双肌”的优良性状。为研究国外进口品种澳洲白绵羊是否携带2种基因的突变位点,本试验以澳洲白绵羊为试验动物,采用PCR-RFLP技术对CLPG、MSTN基因的多态性进行分型。结果发现:CLPG基因上有1个C→T的SNP位点,澳洲白绵羊群体中有CC和CT 2种基因型;MSTN基因在3'-UTR区发现1个G→A的SNP位点,澳洲白绵羊群体中有GG和GA 2种基因型。用R语言程序对所测数据进行性别间不同基因型与生长发育状况的单因素方差分析得知,CLPG和MSTN基因不同基因型对澳洲白公羊体重、体高、体斜长、尻宽、背膘厚和眼肌面积均无显著性影响(P>0.05);CLPG基因CT基因型在母羊体重上显著高于CC基因型(P<0.05),在体斜长上极显著高于CC基因型(P<0.01),MSTN基因GA基因型母羊眼肌面积极显著高于GG基因型(P<0.01)。澳大利亚进口澳洲白绵羊中筛选到含有CLPG和MSTN基因的突变位点,且该突变位点对绵羊体尺性状有显著性作用,因此澳洲白绵羊引进后可以作为改良本地羊品种、基因聚合及三元配套系的终端父本。     

哈萨克羊INHβA基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆哈萨克羊抑制素βA （inhibin beta A,INHβA）基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中绵羊INHβA基因序列（登录号：NM_001009458.1）设计1对特异性引物,通过RT-PCR方法对哈萨克羊INHβA基因进行扩增,将获得的INHβA基因片段插入到pMD19-T载体中进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白跨膜、蛋白修饰位点及二级结构、三级结构模型等。结果显示,哈萨克羊INHβA基因长1 278 bp,编码425个氨基酸。哈萨克羊INHβA基因与绵羊、牛、野猪、小鼠、人、大鼠、猫、兔、马的同源性分别为98.6%、97.7%、90.4%、87.9%、91.1%、88.2%、91.8%、89.8%和91.8%,表明INHβA基因在不同物种之间具有较高的保守性。INHβA蛋白分子式为C₂₀₇₂H₃₃₂₅N₆₀₃O₆₂₈S₂₆,分子质量为47.57 ku,理论等电点（pI）为7.87,不稳定系数为66.16,脂溶指数为78.47,亲水值为-0.507。INHβA是一种碱性不稳定的亲水性脂溶性蛋白,没有跨膜结构,含有信号肽。二级结构预测显示,INHβA蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占22.59%、4.47%、54.12%和18.82%。三级结构预测显示,INHβA蛋白以α-螺旋为主,是含有8种蛋白修饰位点的β-桶状蛋白。本试验结果为深入研究哈萨克羊INHβA蛋白功能及探讨INHβA基因对提高哈萨克羊繁殖力的影响提供参考数据。     

萨福克羊与哈萨克羊、小尾寒羊的杂交生产性能测定

选择3～4岁,体质量相近的适龄小尾寒羊和哈萨克母羊各90只作母本。成年萨福克公羊、小尾寒羊、哈萨克公羊各2只作父本,组成4个杂交组合,以小尾寒羊和哈萨克羊为两个纯繁对照组。采用人工授精的方法,于2003年7～8月配种,2004年1月产羔完毕,哺乳期4个月,在相同的饲养环境下,于2004年9月中旬,即8月龄时,进行屠宰试验和产肉性能分析。萨×哈和萨×其后代胴体质量,比哈萨克羊和小尾寒羊分别高出5.72kg和4.12kg,净肉质量比哈萨克羊和小尾羊分别高4.81kg和3.86kg。增加质量显著(P<0.05)。但萨×哈后代胴体质量、净肉质量比小尾寒羊分别高出12.01kg和10.49kg。增加质量极显著(P<0.01)。     

东佛里生羊MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在研究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因多态性及其对东佛里生羊生长性状的影响。从324只东佛里生羊全血中提取DNA,对MSTN基因外显子序列和非翻译区(untranslated region,UTR)序列进行PCR扩增,采用一代测序技术鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分析不同位点的遗传多态性,并将不同基因型与东佛里生羊的生长性状进行关联分析。结果显示,在东佛里生羊MSTN基因外显子中未检测到突变;在3'-UTR区的272 bp处存在G→A单碱基突变,该位点只检测到AG和AA基因型,且AA基因型频率高于AG基因型;在5'-UTR区的176 bp处存在C→A突变,该位点只检测到CC和AC基因型,且CC基因型频率高于AC基因型。遗传多样性参数分析结果表明,东佛里生羊群体MSTN基因3'-UTR-272和5'-UTR-176位点的纯合度分别为0.827和0.887,杂合度分别为0.173和0.113,2个位点的多态性均较低(PIC<0.25),其群体基因型分布均符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)。关联分析发现,3'-UTR-272位点AG基因型体斜长显著高于AA基因型(P<0.05),5'-UTR-176位点CC基因型胸围显著高于AC基因型(P<0.05),其余指标均无显著差异(P>0.05)。综上,东佛里生羊MSTN基因3'-UTR和5'-UTR突变位点可作为其目标性状选育的分子标记。     

3个绵羊群体MSTN基因编码区PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了3个不同绵羊品种（杜泊绵羊、小尾寒羊、晋中绵羊）肌肉生长抑制素（MSTN）基因的单核苷酸多态性.根据3个绵羊品种MSTN基因Exon1（P1）、Exon2（P2和P3）和Exon3（P4和P5）序列设计5对PCR-SSCP引物并扩增,经SSCP分析,P1位点检测到A和B两个等位基因,AA、AB、BB三种基因型;且在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,而在小尾寒羊和杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P2和P5位点没有检测到多态位点.P3位点检测到A和B两个等位基因,AA、BB两种基因型;且在3个绵羊品种上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P4位点检测到A、B和C三个等位基因,AA、AB、AC三种基因型;且在小尾寒羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg不平衡状态,在杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.