波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋...     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

H9N2亚型禽流感病毒的研究现状

H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认,并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注,相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据,通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组,可以形成新的病毒株,引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒,防止人类流感大流行。     

金丝桃素蛋白络合物在鸡体内对H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果的研究

为了明确金丝桃素蛋白络合物在动物体内H9N2亚型AIV的杀灭效果及临床上用于预防和治疗的剂量，将180只28日龄非免疫石歧杂黄鸡随机为6组，分别为金丝桃素蛋白络合物高、中、低剂量组，金刚烷胺药物对照组，感染不给药组及健康对照组。其中，金丝桃素蛋白络合物三个剂量组的实验鸡于感染H9N2亚型AIV12h后分别以不同的剂量灌服给药，而金刚烷胺药物组于攻毒12h后以10mg/l饮水。用棉拭子采集各实验组鸡的咽喉及泄殖腔黏液，进行微量血凝（HA）试验及RT-PCR检测，以确定各实验组鸡的排毒情况。结果表明，金丝桃素蛋白络合物对人工感染H9N2亚型AIV的实验鸡有较好的保护作用，与金刚烷胺药物对照及感染不给药组相比有显著差异。     

H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列,设计、合成PCR引物。自H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶扩增血凝素基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组血凝素,分子质量约75 ku。采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组血凝素的免疫反应性,结果表明,重组血凝素能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性。     

CBL蛋白表达对H9N2亚型禽流感病毒细胞中复制及感染细胞凋亡的影响

CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在免疫调控、信号传导调节和对多种刺激的反应中起重要作用。本研究的主要目的是探讨真核表达的CBL蛋白对H9N2禽流感病毒增殖及感染细胞的凋亡情况的影响。荧光显微镜下观察真核表达重组载体EGFP-CBL在MDCK细胞内正常表达,qPCR结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞内病毒滴度明显少;Western blot结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞36 h,其凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较大;流式分析结果显示转染EGFP-CBL重组载体的MDCK的早期凋亡细胞的比例少,暗示CBL蛋白能够一定程度上抑制MDCK细胞的凋亡。该结果表明CBL蛋白能在一定程度上抑制H9N2禽流感病毒在MDCK细胞的扩增,并且抑制细胞的凋亡,为深入研究CBL蛋白抗病毒细胞机制提供了重要的试验依据。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠...     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据。结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性。因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义。     

H9N2亚型禽流感病毒复制特性的基因分析

利用反向遗传技术,通过基因重排方法,以A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的6个内部基因为骨架,与A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV的HA和NA基因组合,产生3株H9N2亚型重排AIVs。动物试验发现A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）和A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV主要在呼吸系统复制,A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）株在气管和肺组织的复制能力明显强于A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV株。3株H9N2亚型重排AIVs的动物试验发现HA和NA基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制特性起主要作用。内部基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制也有一定的作用。结果表明1994年中国首次分离到的H9N2亚型AIV经过4年的宿主适应和基因进化,加强了其在呼吸系统的复制能力,奠定了气溶胶传播的基础。     

H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…     

H9N2亚型禽流感病毒流行病学及其疫苗的研究进展

禽流感(avian influenza AI)是由A型流感病毒引起的一种高度接触性传染病。H9N2是A型流感病毒的1个亚型,其谱系复杂,流行范围广,已经成为我国AI的主要亚型。尽管我国自1998年就开始进行H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的防疫,但目前其疫苗株与流行株的抗原性已经出现了较大的差异。带毒野禽的迁徙不仅使H9N2AIV防控难度加大,而且使AI的流行不断复杂化;活禽交易市场为AIV重排以及跨种传播提供了有利的条件。此外,H9N2AIV感染谱在不断扩大,不仅感染哺乳动物,甚至已经感染了人群;因此,有必要重新认识H9N2AIV的兽医学和公共卫生学意义。现就H9N2AIV近年在我国的流行情况及其疫苗的研究进展作一综述。     

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制

利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体（McAbs）进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列的初步分析

禽流行性感冒 ,简称禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ ,ＡＩ)是由正黏病毒科、流感病毒属、Ａ型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合症 ,被国际兽疫局确定为Ｉ类烈性传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。ＯＩＥ根据对家禽所造成的疾病程度 ,将禽流感划分为高致病禽流感ＨＰＡＩ和低致病禽流感ＬＰＡＩ。Ｈ9Ｎ2亚型禽流感病毒 ,属低致病力禽流感病毒。 1994～ 1999年期间 ,该亚型病毒在全球呈广泛流行趋势 ,且危害日趋严重。中国在 1994年 ,由陈伯伦等[1] 人报道 ,在广东某鸡场的蛋鸡中分离到我国第 1株Ｈ9Ｎ2亚型禽…     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达

为表达H9N2亚型禽流感病毒的HA1蛋白,从H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株中扩增其HA1基因片段,将扩增得到的HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化到BL21 (DE3)中进行表达.结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件确定最佳诱导时间为8h,IPTG最佳终浓度为0.8 mmol/L.经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达产物的分子质量约为61 ku.     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

为了筛选免疫原性更好的H9N2亚型禽流感病毒疫苗株。本研究在分析H9N2病毒HA基因遗传进化规律基础上,对预选的毒株进行血凝效价(HA)、鸡胚半数感染量(EID50)测定及交叉血凝抑制试验,筛选出疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,CK/AH/AJ3/15株HA效价达11 log2、EID50值为9.17 log10/0.1 mL,有很好的繁殖能力;对当前流行株的HI反应效价比疫苗株F/98高2-3个滴度;以CK/AH/AJ3/15株制作灭活疫苗,整体保护率达到97.5%,比F/98疫苗株的85%明显提高。表明CK/AH/AJ3/15株可以作为H9N2亚型禽流感新型疫苗株的候选株。     

H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列设计,合成克隆引物。自H9N2亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增NA基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NA,分子量约54·7ku。经免疫印迹及ELISA分析重组NA的免疫反应性和免疫动物分析其免疫原性,结果表明:重组NA能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免疫动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

对1998—2002年间在河南省豫北地区分离到的5株H9N2亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究。经HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验及攻毒保护试验证明，5株H9N2亚型间已经发生了抗原性漂移。98A5和99S毒株间的保护力接近100％，HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验的相关性均在0．74以上。表明2毒株间的抗原性相近；用00Y毒株攻击其他4株免疫的鸡，其保护率仅为60％～80％；而02Y株对除00Y株外的4株的免疫保护率分别为60％、75％、80％、100％，与分离年代呈负相关性，HI、鸡胚中和试验、细胞中和试验也取得类似结果，说明2000年后的毒株间已发生抗原性变异。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。