布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因克隆测序及表达分析

为研究布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列和表达情况及其与生长发育的关系,本实验运用克隆测序方法检测CRTC1、CRTC3基因CDS区,并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织和不同月龄的mRNA相对表达量;并用免疫组化技术对蛋白进行定位分析。结果显示:克隆测序获得的布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因CDS区分别为1773 bp和1725 bp,分别编码590、575个氨基酸;运用生物信息学分析后发现CRTC1、CRTC3结构稳定性差,为亲水性、偏酸性蛋白;进化树显示与牛、瘤牛、山羊和绵羊的同源性高(>80%),蛋白互作网络图显示CRTC1、CRTC3蛋白与FoxO基因家族、AMPK家族等基因相互作用强。qRT-PCR结果显示CRTC1、CRTC3基因分别在睾丸和脂肪中mRNA相对表达量最高(P<0.01),在肌肉组织中亦有表达。在肌肉组织中,CRTC1、CRTC3基因mRNA相对表达量随着年龄的增加逐渐降低;免疫组化显示CRTC1、CRTC3蛋白主要在肌肉组织的肌原纤维中表达。以上结果表明,CRTC1、CRTC3基因调控肌纤维生长发育,进而参与肌肉生长发育相关调节。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列(登录号:XM_018066209.1),利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达(P0.05),其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

草原红牛FABP7基因克隆、生物信息学及组织表达差异分析

本研究旨在克隆草原红牛脂肪酸结合蛋白7基因(FABP7)的CDS区序列并对其进行生物信息学分析,同时检测其在牛各个组织中的mRNA表达水平。利用RT-PCR技术克隆草原红牛FABP7基因CDS区序列,并使用多种生物软件和在线工具进行生物信息学分析,通过qPCR技术检测FABP7基因在各组织间mRNA的表达水平。结果表明:草原红牛FABP7基因CDS区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白分子量为14.96 ku,理论等电点为5.38,属于亲水性蛋白;通过NCBI-BLAST对比发现,草原红牛与普通牛、羊、猪、人、鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99%、98%、94%、92%、85%、85%,系统进化树结果发现,草原红牛与普通牛亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;FABP7蛋白序列有1个二硫键,14个磷酸化位点,1个N-糖基化位点,不存在信号肽和跨膜区;在蛋白的二级结构和三级结构中发现,FABP7蛋白主要存在2个α-螺旋结构和10条β-折叠,为混合型蛋白。FABP7基因在小肠组织表达量最高,在心脏、脂肪和胃中中度表达。     

小尾寒羊SPARCL1基因编码区克隆及表达分析

为了探究小尾寒羊富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1(secreted protein acidic and rich in cysteine like 1,SPARCL1)基因结构及其各组织间表达差异,试验提取小尾寒羊肝脏组织总RNA,根据GenBank中公布的绵羊SPARCL1基因序列设计引物,应用PCR技术扩增SPARCL1基因编码区(CDS)。将扩增产物连接到pMD18-T载体进行测序,获得小尾寒羊SPARCL1基因完整CDS区序列信息,应用生物信息学软件分析序列及蛋白结构。以小尾寒羊心脏、肝脏、肌肉、胃、十二指肠、小肠组织mRNA为模板,通过实时定量荧光PCR技术检测SPARCL1基因在小尾寒羊各组织间的表达差异。结果显示,试验成功获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS 1 962 bp,编码653个氨基酸;分子质量为74.39 ku,理论等电点为4.64,为亲水性蛋白质;SPARCL1基因具有信息肽切割位点,为分泌蛋白;小尾寒羊SPARCL1基因序列与NCBI中绵羊序列同源性为99.80%,SPARCL1基因CDS区出现4处突变位点,但未引起氨基酸改变;SPARCL1蛋白存在77个蛋白磷酸化位点和3个糖基化位点;SPARCL1蛋白表达预测主要定位在细胞质;SPARCL1蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占31.9%、6.4%、28.7%和33.0%,三级结构预测结果与其一致。SPARCL1基因在小尾寒羊皮下脂肪组织中相对表达量明显高于其他组织。本研究成功克隆获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS区完整序列,并对其序列、蛋白理化特性、结构及各组织间表达差异进行了详细分析,为研究小尾寒羊SPARCL1基因功能,探究其在小尾寒羊脂肪代谢过程中可能发挥的作用提供参考依据。     

贵州黑山羊FAS基因CDS区的克隆与组织表达分析

为探究FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达情况,试验参考山羊FAS基因CDS区序列设计合成特异引物,利用PCR技术扩增贵州黑山羊FAS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR检测FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达量。结果：贵州黑山羊FAS基因CDS区全长981 bp,编码326个氨基酸,分子式为C₂₉₅₈H₄₉₃₇N₉₈₁O₁₂₂₁S₁₉₅;其核苷酸序列与绵羊同源性最高,蛋白二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成;FAS基因在贵州黑山羊各组织中均有表达,表达量依次为脂肪>背最长肌>肺脏>大肠>脾脏>肾脏>腿肌>心脏>肝脏>小肠。结论：FAS基因在贵州黑山羊脂肪组织中表达量最高,对贵州黑山羊脂肪形成具有重要调控作用。     

绵羊TPT1基因CDS区遗传结构及组织表达研究

本研究旨在克隆绵羊TPT1基因序列,通过生物信息学分析探究其序列特征及编码蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR检测TPT1基因在绵羊不同组织中的空间表达规律。以小尾寒羊为研究对象,PCR扩增获得TPT1的完整编码区(CDS)区并进行测序,对所得序列进行生物信息学分析。结果显示:绵羊TPT1基因CDS为660 bp,编码219个氨基酸,核酸序列与山羊的同源性最高。TPT1蛋白为亲水性蛋白,主要分布在线粒体,存在16个磷酸化位点;二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,与预测的三级结构相似。定量PCR结果显示TPT1基因在肾中表达量最高,其次是肌肉、肝、脂肪和肺,在心和脾中表达量最低。结果表明,TPT1基因在生物进化中是保守的,但其表达的蛋白质结构不稳定,在绵羊不同组织中均有表达。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列（登录号：XM_018066209.1）,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达（P<0.05）,其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

小尾寒羊SPARCL1基因编码区克隆及表达分析

为了探究小尾寒羊富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1（secreted protein acidic and rich in cysteine like 1,SPARCL1）基因结构及其各组织间表达差异,试验提取小尾寒羊肝脏组织总RNA,根据GenBank中公布的绵羊SPARCL1基因序列设计引物,应用PCR技术扩增SPARCL1基因编码区（CDS）。将扩增产物连接到pMD18-T载体进行测序,获得小尾寒羊SPARCL1基因完整CDS区序列信息,应用生物信息学软件分析序列及蛋白结构。以小尾寒羊心脏、肝脏、肌肉、胃、十二指肠、小肠组织mRNA为模板,通过实时定量荧光PCR技术检测SPARCL1基因在小尾寒羊各组织间的表达差异。结果显示,试验成功获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS 1 962 bp,编码653个氨基酸;分子质量为74.39 ku,理论等电点为4.64,为亲水性蛋白质;SPARCL1基因具有信息肽切割位点,为分泌蛋白;小尾寒羊SPARCL1基因序列与NCBI中绵羊序列同源性为99.80%,SPARCL1基因CDS区出现4处突变位点,但未引起氨基酸改变;SPARCL1蛋白存在77个蛋白磷酸化位点和3个糖基化位点;SPARCL1蛋白表达预测主要定位在细胞质;SPARCL1蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占31.9%、6.4%、28.7%和33.0%,三级结构预测结果与其一致。SPARCL1基因在小尾寒羊皮下脂肪组织中相对表达量明显高于其他组织。本研究成功克隆获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS区完整序列,并对其序列、蛋白理化特性、结构及各组织间表达差异进行了详细分析,为研究小尾寒羊SPARCL1基因功能,探究其在小尾寒羊脂肪代谢过程中可能发挥的作用提供参考依据。     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

梅花鹿Myf5基因的cDNA克隆及表达分析

为获得梅花鹿生肌调节因子(Myf5)基因编码区序列(CDS),并探讨该基因在雌雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间差异表达情况,以成年健康雌雄梅花鹿心肌、背最长肌、股四头肌、臀大肌、肋间肌组织为试验材料,以臀大肌组织cDNA为模板克隆获得Myf5基因CDS,运用生物信息学软件进行测序及分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测Myf5基因在不同部位的肌组织间相对表达量。结果表明：克隆得到的梅花鹿Myf5基因CDS全长为768 bp;与GenBank上公布的家牛(Gene ID:281335)Myf5基因CDS的同源性为99.61%;梅花鹿与家牛的遗传距离最近,聚为同一支;梅花鹿Myf5蛋白氨基酸组成中丝氨酸含量最高,占氨基酸总量的13.3%;Myf5蛋白具有较强的亲水性,其蛋白二级结构包含α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-折叠;荧光定量结果分析表明,梅花鹿Myf5基因在雌、雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间均有差异性表达。     

秦川肉牛AdipoR1和AdipoR2基因克隆、生物信息学分析及表达研究

试验旨在利用生物信息学方法对秦川牛肉用新品系(以下简称“秦川肉牛”)AdipoR1、AdipoR2基因的CDS区进行克隆及分析,并探究其在秦川肉牛不同组织及肌细胞诱导分化不同时间的表达情况。以秦川肉牛为研究对象,经PCR扩增得到AdipoR1、AdipoR2基因CDS区序列,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测,同时采用实时荧光定量PCR术获得AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛15个组织和诱导分化后不同时间的表达量,再进行差异分析。结果显示,秦川肉牛AdipoR1基因编码序列全长为1128 bp,编码375个氨基酸,蛋白分子质量为42446.41 u,理论等电点为6.70,AdipoR1蛋白二级结构主要由α-螺旋构成,二、三级结构预测结果一致,属于亲水性蛋白,没有信号肽位点;AdipoR2基因编码序列全长1161 bp,编码386个氨基酸,蛋白分子质量为43707.70 u,理论等电点为6.27。亚细胞定位结果表明,AdipoR1蛋白有60.9%的可能定位在细胞膜,AdipoR2蛋白有73.9%的可能定位在细胞膜。不同物种氨基酸系统进化树结果显示,秦川肉牛AdipoR1、AdipoR2基因编码的氨基酸序列分别与瘤牛和野牦牛的亲缘性最近。实时荧光定量PCR结果显示,AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛心脏、肝脏、肌肉等15个组织中均有表达,且在肌肉组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),在肌细胞诱导分化时序上也有明显差异。本试验揭示了AdipoR1和AdipoR2基因在秦川肉牛不同组织和肌细胞诱导分化后不同时间上的表达差异,以期为进一步探究AdipoR1、AdipoR2基因的生物学功能与调控机理奠定基础。     

秦川肉牛AdipoR1和AdipoR2基因克隆、生物信息学分析及表达研究

试验旨在利用生物信息学方法对秦川牛肉用新品系（以下简称"秦川肉牛"）AdipoR1、AdipoR2基因的CDS区进行克隆及分析，并探究其在秦川肉牛不同组织及肌细胞诱导分化不同时间的表达情况。以秦川肉牛为研究对象，经PCR扩增得到AdipoR1、AdipoR2基因CDS区序列，运用生物信息学软件对其功能结构进行预测，同时采用实时荧光定量PCR术获得AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛15个组织和诱导分化后不同时间的表达量，再进行差异分析。结果显示，秦川肉牛AdipoR1基因编码序列全长为1 128 bp，编码375个氨基酸，蛋白分子质量为42 446.41 u，理论等电点为6.70，AdipoR1蛋白二级结构主要由α-螺旋构成，二、三级结构预测结果一致，属于亲水性蛋白，没有信号肽位点；AdipoR2基因编码序列全长1 161 bp，编码386个氨基酸，蛋白分子质量为43 707.70 u，理论等电点为6.27。亚细胞定位结果表明，AdipoR1蛋白有60.9%的可能定位在细胞膜，AdipoR2蛋白有73.9%的可能定位在细胞膜。不同物种氨基酸系统进化树结果显示，秦川肉牛AdipoR1、AdipoR2基因编码的氨基酸序列分别与瘤牛和野牦牛的亲缘性最近。实时荧光定量PCR结果显示，AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛心脏、肝脏、肌肉等15个组织中均有表达，且在肌肉组织中的表达量最高，极显著高于其他组织（P<0.01），在肌细胞诱导分化时序上也有明显差异。本试验揭示了AdipoR1和AdipoR2基因在秦川肉牛不同组织和肌细胞诱导分化后不同时间上的表达差异，以期为进一步探究AdipoR1、AdipoR2基因的生物学功能与调控机理奠定基础。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

犏牛PPP1R11基因的克隆及在睾丸中的表达规律研究

旨在克隆犏牛蛋白磷酸酶1调节亚基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11,PPP1R11)基因,分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为解析其在雄性生殖中的功能机制提供理论依据.本研究采集成年犏牛睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪组织(n=3...     

山羊溶酶体α-AMA基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析

本研究旨在对山羊溶酶体α-甘露糖苷酶(α-AMA)基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛α-AMA基因序列设计引物,采用PCR技术克隆山羊α-AMA基因序列,并利用荧光定量RT-PCR进行组织表达谱分析以及进行生物信息学预测。首次获得了山羊α-AMA基因,含有完整CDS编码区3 000bp,编码999个氨基酸,其中前50个氨基酸为信号肽序列。其编码区的核苷酸序列和预测氨基酸序列与牛的α-AMA相似性最高,分别为95.93%和94.79%。组织表达谱分析表明α-AMA在山羊各组织均不同程度的表达,其中在肺脏、肝脏、小脑表达量较高。生物信息学预测发现,α-AMA蛋白属于糖苷水解酶38家族成员,有2个保守的结构域,存在9个N-糖基化位点。SWISS-MODEL同源建模山羊α-AMA具有良好的可信度。本研究为探讨酶的作用机理及疯草解毒剂的研制提供了理论依据。     

猪CCAR1基因细胞定位、表达特性及对细胞增殖的影响

旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列，研究其亚细胞定位和表达特性，探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区，通过测序和序列拼接获得完整CDS区；采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位；采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因，通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8（cell counting kit 8）技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明，猪CCAR1基因的完整CDS区长3 459 bp（MH301308.1），在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似，在所检测的组织中均有表达，均表现为在肾和小肠中表达量最高，在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达，在心和皮下脂肪中低表达；CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达，在转染48 h后，相比于对照组，试验组都对细胞增殖产生极显著抑制（P<0.01）；CCAR1基因敲除后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降（P<0.05），Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降（P<0.05），Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达，可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖，在猪的生长发育过程中起重要作用。     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P<0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

Cellular Localization,Expression Patterns of CCAR1 Gene,and Its Effect on Cell Proliferation in Pig

The aim of this study was to obtain the complete coding sequence (CDS) of CCAR1 gene, and to explore its subcellular localization, expression profile and its effects on cell prolification and action mechanism in pig. In this study, the cDNA from kidney tissue of 1-day-old Mashen pigs were used as the template to obtain the full-length CDS of CCAR1 gene by RT-PCR and sequencing. The cellular immunofluorescence staining was used to explore the subcellular localization of CCAR1 in PK15 cells. The temporal and spatial expression profile of CCAR1 was investigated by qRT-PCR in this study. The CCAR1 gene in PK15 cells was knocked out by using CRISPR/Cas9 gene editing technology, and the effects of CCAR1 gene on cell proliferation and expression of cell proliferation and apoptosis related genes were investigated by qRT-PCR, Western blot and CCK8 (cell counting kit 8) technologies in this experiment. The results showed that the complete CDS region of pig CCAR1 gene was 3 459 bp in length (MH301308.1). CCAR1 protein was localized in both cytoplasm and nucleus of PK15 cells. The expression profiles of CCAR1 mRNA between Large White and Mashen pigs was similar, which was expressed in all detected tissues, with the highest expression in kidney and small intestine, middle expression in spleen, liver, cerebellum and muscle, and the lowest expression in heart and subcutaneous fat. Temporal expression results showed that CCAR1 was expressed in both psoas muscle and longissimus dorsi muscle at 3 developmental stages both in Mashen and Large White pigs. The CRISPR/Cas9 gene editing system effectively reduced the expression of CCAR1. CCK8 results showed that after 48 hours of transfection, compared with the control group, the proliferation of cells in the experimental groups were extremely significantly inhibited (P<0.01). After CCAR1 gene knocked out, the expression level of Mki67, a marker of cell proliferation, was significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in the expression level of Caspase3 and the core protein β-catenin in Wnt pathway between control group and experimental groups, and the expression level of downstream target gene C-myc of Wnt pathway was decreased significantly(P<0.05). CCAR1 gene was expressed almost in all tissues at different developmental stages, and affected cell proliferation by regulating the expression levels of Mki67 and C-myc, and played an important role in growth and development of pig.