肉碱对冻融猪精子总抗氧化能力、抗氧化酶基因及凋亡相关基因表达的影响

试验旨在探究肉碱对冻融猪精子质量、抗氧化、抗凋亡及精卵结合能力的影响。试验分鲜精组和冻融组,冻融组的肉碱浓度分别为0、0.025、0.05、0.075 mg/mL,对冻融后的精子质量、总抗氧化能力、抗氧化酶相关基因及凋亡相关基因mRNA表达、精卵结合能力进行检测。结果显示,在冻融组中,经过肉碱处理的精子存活率、质膜完整率和顶体膜完整率均显著高于0 mg/mL处理组(P0.05),其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时改善效果最好;经过冻融处理的精子中丙二醛(MDA)浓度与鲜精组相比显著升高(P0.05),其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时显著低于其他肉碱处理组(P0.05);与鲜精组相比,各冻融组精子总抗氧化能力均显著降低(P0.05),肉碱浓度为0.05 mg/mL时总抗氧化能力最高。此外,与鲜精组相比,0 mg/mL肉碱处理组中凋亡相关基因Caspase-3与Bax的相对表达量显著升高(P0.05),抗凋亡基因Bcl-2的相对表达量显著降低(P0.05),抗氧化酶相关基因SOD2、CAT与GPx的相对表达量显著降低(P0.05);冻融组精卵结合能力均下降,但肉碱浓度为0.05 mg/mL时可得到显著改善(P0.05)。结果表明,添加肉碱可以改善冻融猪精子的质量、抗氧化能力、抗凋亡能力及精卵结合能力。     

CLC对冻融牛精子体外获能及抗氧化、抗凋亡能力的影响

本研究目的是评价CLC对牛冻融精子获能、抗氧化及抗凋亡能力的影响。试验分对照组和CLC处理组(0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL),检测冻融牛精子体外获能后的酪氨酸磷酸化水平以及冻融牛精子抗氧化基因和细胞凋亡基因的表达。结果:1)在0.5 mg/mL CLC处理组冷冻效果最好,与对照组和1.0 mg/mL CLC处理组相比无显著差异;2)冻融牛精子获能处理后,在1.0 mg/mL CLC处理组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平最高,与对照组相比无显著差异;3)在0.5 mg/mL CLC处理组冻融牛精子抗氧化基因CAT、GPX和SOD的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05);4)在0.5和1.0 mg/mL CLC处理组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和BAX的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论:添加CLC可以改进冻融牛精子获能和抗氧化、抗凋亡能力。     

肉碱对冻融猪精子总抗氧化能力、抗氧化酶基因及凋亡相关基因表达的影响

试验旨在探究肉碱对冻融猪精子质量、抗氧化、抗凋亡及精卵结合能力的影响。试验分鲜精组和冻融组,冻融组的肉碱浓度分别为0、0.025、0.05、0.075 mg/mL,对冻融后的精子质量、总抗氧化能力、抗氧化酶相关基因及凋亡相关基因mRNA表达、精卵结合能力进行检测。结果显示,在冻融组中,经过肉碱处理的精子存活率、质膜完整率和顶体膜完整率均显著高于0 mg/mL处理组（P < 0.05）,其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时改善效果最好;经过冻融处理的精子中丙二醛（MDA）浓度与鲜精组相比显著升高（P < 0.05）,其中肉碱浓度为0.05 mg/mL时显著低于其他肉碱处理组（P < 0.05）;与鲜精组相比,各冻融组精子总抗氧化能力均显著降低（P < 0.05）,肉碱浓度为0.05 mg/mL时总抗氧化能力最高。此外,与鲜精组相比,0 mg/mL肉碱处理组中凋亡相关基因Caspase-3与Bax的相对表达量显著升高（P < 0.05）,抗凋亡基因Bcl-2的相对表达量显著降低（P < 0.05）,抗氧化酶相关基因SOD2、CAT与GPx的相对表达量显著降低（P < 0.05）;冻融组精卵结合能力均下降,但肉碱浓度为0.05 mg/mL时可得到显著改善（P < 0.05）。结果表明,添加肉碱可以改善冻融猪精子的质量、抗氧化能力、抗凋亡能力及精卵结合能力。     

EGF对牦牛冻精运动性能、细胞凋亡和IVF胚胎发育潜力的影响

本研究旨在探明牦牛冻精体外获能过程中,EGF是否调控精子的细胞凋亡、运动性能及其对后续胚胎发育的影响。在牦牛冻精体外获能过程中,加入不同浓度EGF(0、50、75、100、150和200ng·mL-1),应用精子分析仪分析不同处理组精子活性;运用qRT-RCR、Western blot检测Bax和Bcl-2的表达;评估IVF后受精胚的发育能力。结果表明:1)EGF可显著提高牦牛冻精运动性能、胚胎卵裂率(P0.05),且这种调控具有一定的浓度依赖性。2)75~150ng·mL~(-1) EGF可以显著提高获能冻精Bcl-2基因和蛋白表达,降低Bax表达(P0.05)。综上表明,牦牛冻精体外获能过程中,EGF不仅降低牦牛冷冻精子的细胞凋亡和提高牦牛精子运动性能,而且能够提高IVF后胚胎发育潜力,且其最佳作用浓度为75~150ng·mL~(-1)。本研究为通过生长因子作用提高牦牛体外胚胎生产提供重要参考信息。     

精子不同筛选处理方法对体外受精效果的影响

为了比较体外受精所用精子的不同筛选及获能处理方法对肉羊体外受精效果的影响,试验采用离心法和上浮法处理精子。结果表明:试验1组、试验2组中,鲜精组受精率分别为(69.6±4.5)%、(68.3±1.7)%,冻精组受精率分别为(68.4±1.9)%、(67.5±2.1)%,均显著高于对照组鲜精组、冻精组受精率[(35.1±1.6)%、(28.3±2.4)%](P0.05)。试验1组、试验2组中,鲜精组卵裂率分别为(65.6±3.5)%、(64.8±4.2)%,冻精组卵裂率分别为(63.6±4.1)%、(62.9±2.8)%,均显著高于对照组鲜精组、冻精组卵裂率[(33.7±4.1)%、(30.1±3.4)%](P0.05)。试验1组、试验2组中,鲜精组囊胚率分别为(36.8±1.6)%、(32.7±3.3)%,冻精组囊胚率分别为(36.1±3.6)%、(31.1±4.2)%,均显著高于对照组鲜精组、冻精组囊胚率[(14.3±2.5)%、(11.6±4.3)%](P0.05)。精子获能诱导剂肝素组体外受精效果显著好于咖啡因组。     

不同获能条件对猪精子体外获能和体外受精的影响

探讨猪精子在mTBM和TALP中分别获能2、3、4、5h和6h对体外获能的影响,并研究最适获能时间的精子体外受精的效果。结果表明:随着获能时间的延长,猪精子顶体反应率逐渐升高、质膜完整性逐渐下降,获能6h时的顶体反应率显著高于其他时间组,分别为52.5%和50.8%(P<0.05);质膜完整性显著低于其他时间组,分别为30.5%和31.4%(P<0.05);可获能4h的超激活运动率显著高于其他时间组,分别为56.6%和54.5%。将鲜精与冻融的精子获能4h后与成熟的猪卵母细胞进行体外受精,mTBM处理组的卵裂率显著高于TALP,分别为42.7%与40.2%和35.9%与33.4%,但鲜精与冷冻精液组间差异不显著。     

组织培养液M199在庆阳驴细管精液中的应用

为了研究M199对庆阳驴细管鲜精和细管冻精活力及保存时间的效果影响。在鲜精稀释液中,添加不同浓度的M199,在低温保存下,观察不同时间段精子活力;在冻精稀释液中,添加1%的M199,采用液氮熏蒸制作冻精,解冻后观察冷冻效果。结果显示,在低温保存中,稀释液中添加1%的M199,48h后精子活力仍然在0.35以上,与其他试验组和对照组差异极显著(P0.01)。在冻精稀释液中添加1%的M199,试验组与对照组冻后精子活率分别为30.83%和31.33%,两者之间差异不显著(P0.05),但试验组精子有效存活时间显著高于对照组。通过在庆阳驴精液稀释液中添加M199,均能很好的延长精子保存时间。     

红景天多糖对藏猪精液冻后品质及精子基因组DNA甲基化的影响

在藏猪精液的冷冻液中添加不同质量浓度的红景天多糖(0,2,4,6,8,10mg/L),制成高密度细管冻精,以冷冻解冻后精子活率、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为精液品质的评价指标,筛选最适红景天多糖添加质量浓度;用甲基化荧光定量法检测3组(鲜精组、未添加组、最适添加组)精子基因组DNA甲基化的水平。结果显示:添加红景天多糖质量浓度为6mg/L组的精子活率显著高于其他组(P<0.05),该组精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率也显著好于未添加组(P<0.05);这3组精子基因组的DNA甲基化水平(0.610 5±0.080 0,0.945 7±0.043 7,0.680 2±0.051 0)中,最适添加组虽显著高于鲜精组(P<0.05),但却显著低于未添加组(P<0.05)。结果表明:在藏猪精液冷冻液中添加质量浓度6mg/L的红景天多糖不仅可以明显改善藏猪精液冻后品质,而且可以明显减少冷冻对藏猪精子基因组DNA甲基化水平的影响,这将为提高藏猪精液冷冻保存效果的进一步研究提供参考。     

水蛭素对猪精液冻后质量的影响

试验用含不同浓度(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)水蛭素的稀释液稀释美系公猪精液,并以0.25mL细管分装冷冻。结果显示:(1)水蛭素浓度为0、0.02%时在冻后精子畸形率或水蛭素浓度为0、0.12%时冻后精子顶体完整率上存在明显的品种效应(P0.05);(2)3种公猪各浓度组(除大约克和杜洛克公猪0.02%浓度组外)冻后精子活力均显著高于对照组(P0.05),且均在浓度为0.08%时最高;除了长白公猪0.02%浓度组冻后精子畸形率显著低于对照组(P0.05)外,3种公猪各浓度组与对照组差异均不显著(P0.05);大约克公猪各试验组、杜洛克公猪0.08%浓度组及长白公猪0.02%、0.06%及0.08%浓度组冻后精子顶体完整率显著高于对照组(P0.05),且均在浓度为0.08%时最高,长白及杜洛克公猪其他试验组与对照组差异均不显著(P0.05)。结果表明,适宜浓度的水蛭素可以显著提高猪精液冻后质量,效果最好的浓度为0.08%。     

冷冻保存对公猪精子功能的影响

试验旨在探究公猪精液冷冻保存对其精子功能的影响。取长白猪的鲜精和优质冻精,用精子分析仪检测精子的运动能力,台盼蓝染色检测精子活率,体外受精（IVF）试验检测卵裂率与囊胚率,采用不同功能检测试剂盒检测冻精和鲜精的顶体完整率、线粒体膜通道孔（MPTP）活性、线粒体膜电位（MMP）、线粒体活性、线粒体氧化应激活性氧（ROS）以及精子DNA完整性,实时荧光定量PCR检测弱精子症相关蛋白基因SMCP、TEKT3、DNAH1、TCTE3的表达。结果表明,与猪鲜精相比,猪冻精的活率及活力均显著降低（P<0.05）,冻精的顶体完整率也明显下降（P<0.05）;冻精的卵裂率和囊胚率显著低于鲜精（P<0.05）;精子线粒体功能分析结果显示,冻精的MPTP相对荧光单位值（RFU）、线粒体膜电位荧光比率以及线粒体活性光密度（OD）值均显著低于鲜精（P<0.05）;精子线粒体ROS检测发现,冻精的RFU值显著高于鲜精（P<0.05）;精子DNA完整性检测结果显示,冻精拖尾率显著高于鲜精（P<0.05）;而弱精子症相关蛋白基因的表达与鲜精相比,差异不显著（P>0.05）。综上所述,冷冻导致猪精子活率、活力、线粒体功能、DNA完整性下降,最终使得冷冻精液精子的受精能力降低。     

不同添加剂及剂型对猪冷冻精液品质的影响

试验旨在研究咖啡因、维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)及剂型对猪冷冻精液品质的影响。采用添加了不同浓度咖啡因、维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)的冷冻稀释液和3种剂型的冻精管进行精液冷冻。3种添加剂对冻精解冻后的精液品质都有一定的促进作用,试验中其添加最适浓度分别为:咖啡因为0.2 mg/mL,维生素E为0.4 mg/mL,SOD为300 IU/mL;0.25mL剂型的冻精解冻后精子品质最好。咖啡因、抗氧化剂及冻精管剂型对冷冻精液的效果有一定的影响。     

β-谷甾醇、淫羊藿苷对猪精子体外获能效果的影响

探讨中药单体成分β-谷甾醇(β-sitosterol)、淫羊藿苷(Icariin,Ica)对猪精子体外获能的影响,以期提高体外受精效果.以mTBM+肝素获能液为对照组,分别添加β-谷甾醇、淫羊藿苷的低、中、高3个剂量为试验组,利用金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC)法结合体外受精检验体外获能效果.在mTBM+肝素中添加β-谷甾醇2(中剂量0.08 mg/L)、淫羊藿苷2(中剂量17 mg/L)的B型精子率(获能精子)显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.05),F型精子率(未获能精子)显著低于对照组和其他剂量组(P＜0.05),AR型精子率(发生顶体反应精子)与对照组和其他剂量组差异不显著(P0.05),卵裂率和囊胚率均极显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.01);表明中药单体成分β-谷甾醇、淫羊藿苷能够显著促进猪精子体外获能效果.     

维生素P对低温保存猪精液的影响

在猪精液稀释液(Zorlesco)中分别添加0,40,80,120,160,200μg/mL的维生素P,研究其对猪精子低温保存的影响。结果表明,维生素P的添加显著延长了猪精子低温保存时间,在各试验组中,维生素P的最适添加浓度为160μg/mL。在该浓度下,维生素P并对第3天时精子的活力、活率、顶体完整率、低渗肿胀率及线粒体活性作用效果不明显(P0.05)。在第6天时,维生素P显著地提高了精子的活力、活率、顶体完整率和质膜完整率(P0.05),但对精子线粒体活性没有显著影响(P0.05)。在保存第9天时,猪精子的活力、活率、顶体完整率、低渗肿胀率及线粒体活性与对照组相比具有显著的提高(P0.05)。     

枸杞多糖对己烯雌酚暴露成年仓鼠睾丸Caspase-8、Caspase-9及p53凋亡蛋白的影响

66只成年雄性仓鼠随机分为空白对照组(A)、DES组(B)、1 mg/kg LBP组(C)、10 mg/kg LBP组(D)、50mg/kg LBP组(E)及VC+VE组(F)。除对照组外,其余5组均皮下注射1mg/kg己烯雌酚,对照组注射等剂量的橄榄油,连续用药7d,同时C、D、E组分别灌服1、10、50mg/kg的LBP,F组灌服100mg/kg的VC及200IU/kg的VE,A、B组灌服等剂量的生理盐水。于末次给药24h后,乙醚麻醉致死仓鼠,取睾丸进行免疫组化检测,确定Caspase-8、Caspase-9和p53的表达。结果显示,通过免疫组化法检测证实,DES引起成年仓鼠睾丸内生精细胞大量凋亡,显著提高Caspase-9的表达(P0.01);给予不同剂量的LBP后,Caspase-9及p53的表达呈剂量依赖性降低,以LBP高剂量组(50mg/kg)表达最低(P0.01),同时LBP高剂量组的Caspase-8阳性表达与对照组相比差异不显著。结果表明,枸杞多糖可以降低己烯雌酚所致成年仓鼠生精细胞中凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9和p53的表达,且以50mg/kg剂量作用最为显著。     

不同稀释方法对小型宠物犬精液冷冻效果影响

为了研究Tris-果糖稀释液在不同稀释方法下对小型宠物犬精液冷冻的效果,选取常见的3个小型宠物犬品种共计6只犬进行试验,精液稀释过程分别采用一步稀释法和两步稀释法。结果表明:冷冻精液解冻后各组犬精液的同一剂型间的精子活力差异均不显著(P0.05);一步稀释法中的颗粒冻精与0.25 mL细管冻精和0.50 mL细管冻精相比,解冻后精子活力差异均显著(P0.05),而0.25 mL细管冻精与0.50 mL细管冻精的解冻后精子活力差异极显著(P0.01);采用两步稀释法的颗粒冻精、0.25mL细管冻精及0.50 mL细管冻精的解冻后精子活力组间差异均不显著(P0.05)。用Tris-果糖稀释液稀释精液时,使用两步稀释法对不同冻精剂型的精子活力影响不明显。     

鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

旨在探究鸽蛋低密度脂蛋白(LDL)对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响。试验分为5组,分别是鲜精组、3%LDL(-80和-196℃)处理组、9%LDL(-80和-196℃)处理组。采用CASA系统分析不同处理组添加不同浓度鸽蛋LDL对冷休克及冻融前后猪精子生物学性状的影响;通过SDS-PAGE、Western blotting、PCR扩增检测分析HSP70蛋白及凋亡基因表达量的变化。结果表明:猪精子经过冻融处理后,热休克蛋白HSP70的表达量高于鲜精组,同时添加9%鸽蛋LDL并置于-196℃保存的冻融精子的热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异(P0.05);在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l试验中,鲜精组的基因表达量均高于其他处理组,添加9%LDL(-196℃)处理组的基因表达量与鲜精组无显著差异(P0.05);在促凋亡基因Bak试验中,鲜精组的基因表达量最低,且添加9%LDL(-196℃)处理组的Bak基因表达量与鲜精组无显著差异(P0.05)。添加鸽蛋LDL可在一定程度上降低猪精子在冻融过程中造成的损伤,维持猪精子正常生物学性状,提高猪精子存活率。     

多种因素对小鼠卵母细胞体外受精效果影响的分析

为了探讨不同精子获能时间,精卵孵育时间,精子密度以及颗粒细胞对小鼠卵母细胞体外受精的影响,从而达到对卵母细胞体外受精体系优化的目的。比较了精子获能时间分别为40 min、60 min、80 min试验组的受精卵卵裂率。结果表明,带颗粒细胞卵母细胞(COCs)在三个试验组中卵裂率无显著差异,不带颗粒细胞卵母细胞(NO)在精子获能时间为60 min时卵裂率最高;比较了精卵孵育时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h试验组的受精卵卵裂率,结果显示COCs精卵孵育时间2 h试验组的效果最好,NO孵育时间为6 h试验组的效果最好;比较了精子密度分别为3×10⁵/mL,3×10⁶/mL,3×10⁷/mL试验组受精卵卵裂率,结果显示COCs和NO均为3×10⁶/mL试验组卵裂效果最好;比较COCs和NO的受精卵卵裂率,结果显示COCs与NO之间存在显著差异(P<0.05),裸卵卵裂效果显著优于颗粒细胞卵裂效果。试验结果表明,在卵母细胞体外受精过程中,精子获能时间60 min,精子密度为3×10⁶/mL,精卵孵育6 h,培养24 h后卵裂率最高。     

甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。     

不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能效果的影响

为了探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能的影响,试验随机取塔里木马鹿冻融精子,添加到SP-TALIP获能液中并添加不同浓度(0,10,20,50,100μg/m L)的肝素,在显微镜下检测0,2,4,6,8小时时的精子活力,试验采用金霉素(CTC)染色法检测精子获能率及顶体反应率等指标,探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子活力、存活时间、获能率、顶体反应率的影响。结果表明:精子活力随肝素浓度升高而呈下降趋势,4 h后10μg/m L和20μg/m L肝素组精子活力显著高于其他组(P0.05),其中20μg/m L肝素组精子存活时间最长,显著高于其他组(P0.05)。随着培养时间的延长,各试验组精子获能率与对照组相比明显提高,2小时、4小时时20μg/m L肝素组精子获能率显著高于其他组(P0.05);各试验组精子顶体反应率与对照组相比有升高趋势。说明获能液中添加20μg/m L肝素可有效诱导塔里木马鹿精子体外获能。     

甘油为抗冻剂超低温冷冻保存大黄鱼精子的DNA损伤

以甘油(Gly)为抗冻剂、0.5 mL麦细管为冻存管,两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,用单细胞凝胶电泳(SCGE)法检测冻精核的DNA损伤。结果表明:以Cortland液为稀释溶液,5%~20%Gly为抗冻剂,超低温冷冻保存大黄鱼精子的效果较佳,冻精活力与鲜精活力无显著差异;Gly浓度为10%,冻精的激活率和运动时间分别达89.93%和8.91min;25%、30%Gly组冻精活力显著下降;SCGE检测显示,Gly浓度5%~20%时,冻精核DNA损伤与鲜精无显著差异,Gly浓度25%及30%时,冻精核DNA损伤与鲜精差异显著;鲜精与冻精的DNA损伤主要表现为轻度和中度损伤,重度损伤比率较低,完全损伤只存在于25%Gly及30%Gly组的冻精中,且比例低。