miR-215-5p通过靶向NCOA3基因抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化

为揭示miR-215-5p在固始鸡腹部脂肪沉积中的作用机制,本研究采用实时荧光定量PCR,分析了 miR-215-5p在14周龄固始鸡8种组织和腹部前脂肪细胞分化过程的表达特征;通过miR-215-5p mimics和inhibitors转染试验,利用CCK-8、EdU、油红O染色、甘油三酯含量测定等方法,分别评价了 ...     

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB （inhibin subunit beta B,INHBB）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4,SMAD4）和成纤维细胞生长因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）基因之间的靶向关系,本研究对多个物种（绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔）中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组（P<0.01;P<0.05）;而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异（P>0.05）。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。     

苜蓿源miR168b通过靶向肉碱棕榈酰转移酶1A对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和脂滴积累的调控研究北大核心CSCD

本试验旨在探究苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖和凋亡的影响。试验首先通过CCK8、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、流式细胞术、基因和蛋白定量等方法检测苜蓿源-miR168b(mtr-miR168b)对BMECs增殖、凋亡和周期的影响。然后,敲低mtr-miR168b靶基因肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)表达后,检测了BMECs的活力和凋亡。通过诱导转染后细胞,用氟硼二吡咯(Bodipy)染色和油红O染色检测mtr-miR168b和CPT1A基因干扰对BMECs脂滴合成的影响。结果表明:1)mtr-miR168b高表达极显著降低了BMECs活力(P<0.01)。2)mtr-miR168b高表达极显著抑制了BMECs增殖(P<0.01),延长了细胞G1~S期进程,极显著促进了细胞凋亡(P<0.01)。3)mtr-miR168b在BMECs中高表达极显著抑制了细胞增殖基因周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)的基因的表达水平(P<0.01),极显著增加了凋亡标志基因Bcl2关联X蛋白(BAX)基因的表达水平(P<0.01),极显著抑制了PCNA蛋白表达水平(P<0.01),极显著增加了BAX蛋白表达水平(P<0.01),并且mtr-miR168b显著抑制了蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表达水平(P<0.05)。4)mtr-miR168b高表达抑制了BMECs中脂滴的积累。5)干扰mtr-miR168b的靶基因CPT1A,对BMECs脂滴积累也有抑制作用。综上所述,mtr-miR168b可通过抑制BMECs增殖,促进细胞凋亡,并通过靶向CPT1A基因抑制BMECs中脂滴的生成。试验结果可为mtr-miRNAs调控牛奶乳脂合成提供分子层面的技术支撑。     

miRNA-200a通过靶向ZEB1参与调节鸡胸肌细胞增殖分化

ZEB1在细胞增殖分化中发挥关键作用,然而关于ZEB1在鸡胸肌细胞增殖分化过程中的功能及其与miRNA互作的研究极少。为探索miRNA如何通过靶向ZEB1参与调节鸡胸肌细胞增殖分化,实验检测了ZEB1在55周龄和20周龄鸡胸肌组织中的表达,使用Target Scan及miRDB在线软件预测鸡ZEB1基因的靶向miRNA,构建ZEB1野生型、突变型双荧光报告载体,并在DF1细胞中验证了ZEB1的靶向miRNA,双荧光素酶报告实验结果说明miR-200a通过特异性结合ZEB1 3'非编码区种子序列直接靶向并抑制ZEB1基因的表达。结果表明:由于miR-200a在55周龄鸡胸肌表达下调,对ZEB1的抑制作用减弱,导致ZEB1在55周龄固始鸡胸肌组织表达较20周龄显著升高(P0.01)。本研究首次在鸡上证明miR-200a是ZEB1的靶向miRNA,且miR-200a可能通过靶向ZEB1参与调节鸡胸肌细胞的增殖分化,为深入理解miRNAs在家禽及其他鸟类中的分子调节机制提供了基础与依据。     

miR-188对小鼠乳腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

【目的】探讨microRNA-188-5p(miR-188)在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用,以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】培养小鼠乳腺癌细胞(4T1),建立4T1细胞小鼠移植瘤模型,分离肿瘤组织和瘤旁组织,用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况;在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物(miR-188 mimics)、模拟物对照(mimics-NC)、miR-188抑制物(miR-188 inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞为空白对照(Con),用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕试验检测细胞的迁移率,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织(P<0.05);细胞转染结果表明,与Con组相比,miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调(P<0.05),而miR-188 inhibitor组显著...     

miR-33a靶向Lipin1和IRS2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在揭示miR-33a在绵羊前体脂肪细胞分化中的生物学功能。本研究以15日龄雄性绵羊背部皮下前体脂肪细胞为试验材料,所有的试验均设立3个重复;利用生物信息学软件预测miR-33a的靶基因,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;用qPCR和Western blotting分别检测miR-33a、Lipin1和IRS2及其编码蛋白的表达,以揭示miR-33a与其靶基因在绵羊前体脂肪细胞分化中的表达规律;慢病毒介导实现miR-33a的过表达和干扰后,检测Lipin1、IRS2和成脂标志基因的表达,并用油红O染色检测脂滴沉积能力,以解析miR-33a对其靶基因的调节机制。生物信息学分析发现,miR-33a与Lipin1和IRS2 3'-UTR都存在结合位点,miR-33a显著下调Lipin1和IRS2野生型双荧光质粒的相对荧光活性（P<0.05）;在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达趋势相反;过表达miR-33a后,显著下调了Lipin1（P<0.01）和IRS2（P<0.05）及其编码蛋白以及成脂标志基因的表达;干扰miR-33a后,这些基因和蛋白的表达则显著上调;过表达miR-33a减少了脂滴沉积,干扰miR-33a促进了脂滴沉积。在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达呈负相关。miR-33a靶向Lipin1和IRS2的3'-UTR抑制绵羊前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

过表达IL-6对山羊毛囊干细胞增殖和迁移的影响

旨在通过在山羊毛囊干细胞(HFSCs)中过表达炎症因子白细胞介素6(IL-6),探讨其对山羊HFSCs增殖和迁移的影响,阐明MAPK/ERK信号通路在山羊HFSCs增殖和迁移过程中发挥的作用。本试验通过构建pXJ40-myc-IL-6过表达载体,瞬时转染到山羊HFSCs中,以空载体细胞为空白对照组。利用Western blot定量检测IL-6蛋白的表达,MTT法检测山羊HFSCs的增殖活力,划痕试验判定山羊HFSCs的迁移能力,最后采用Westernblot检测山羊HFSCs中MAPK/ERK和P38信号通路中关键激酶的表达水平。结果表明,将获得的IL-6过表达载体转染至山羊HFSCs3d后,与对照组比较,山羊HFSCs的增殖活力出现抑制,且抑制效果持续至第7天(P<0.05)。IL-6过表达载体转染至山羊HFSCs24h后,处理组划痕部位的愈合率达到84.2%,显著低于对照组的98.5%(P<0.01)。与对照组相比,MAPK/ERK信号通路中的关键激酶ERK1/2的磷酸化水平(p-ERK1/2)显著下调(P<0.01),P38信号通路中的关键激酶p38的磷酸化水平(p-p38)表达量上调,但差异无统计学意义(P>0.05)。综上所述,过表达IL-6基因对山羊HFSCs的增殖和迁移能力具有抑制作用,且过表达IL-6可能是通过MAPK/REK信号通路对山羊HFSCs增殖和迁移发挥负性调控作用,以上结果为揭示山羊HFSCs的迁移及组织修复机制的研究提供依据。     

鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响

为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况,并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)组和健康组肉鸡中(各3只)各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后,通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP5 3'UTR的野生型载体和突变型载体,通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明,本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示,miR-15a在各组织中均有表达,与健康组相比,miR-15a在VVD组的肝(P < 0.01)、脾(P < 0.05)、胸腺(P < 0.01)中的表达量显著升高,在心和胸肌组织中的表达量显著降低(P < 0.01)。CCK8与EDU分析结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低(P < 0.01),增殖细胞数量显著减少(P < 0.01)。qPCR结果显示,与mimics NC组相比,miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低(P < 0.05),Fas基因表达量极显著上升(P < 0.01),FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降(P < 0.01)。成功构建了FKBP5 3'UTR野生型和突变型载体,双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞,过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。