非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。     

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备猪δ冠状病毒（PDCoV）N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学（IHC）检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示：通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生...     

非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备

本研究旨在制备非洲猪瘟病毒（ASFV） S273R蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的非洲猪瘟病毒重组S273R蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的S273R蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了4株可稳定分泌抗ASFV S273R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过免疫印迹（Western blot）和免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）测定了其免疫特性。4株单克隆抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链。本研究获得的非洲猪瘟病毒S373R蛋白单克隆抗体可为进一步研究ASFV pS273R的生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备

为获得副流感病毒5型SH蛋白的单克隆抗体，将构建的重组表达质粒pET43a-SH转化BL21(DE3)plys，经IPTG诱导表达、过镍柱纯化后将重组蛋白作为免疫原，免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光方法进行筛选，获得3株杂交瘤细胞株，命名为5B9、3G8、4E11，并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传代10代均稳定分泌单克隆抗体，细胞上清液IFA效价稳定，分泌单克隆抗体亚型均为IgG2a。制备并纯化了1株(5B9)单克隆抗体，浓度为4.26 mg/mL，纯度不低于90%，IFA效价不低于1∶2000，与猪牛等常见病毒均无交叉反应。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP8蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)NSP8蛋白的抗原表位,本研究对GST-NSP8重组蛋白进行了原核表达,并用纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏,采用常规杂交瘤细胞融合方法,经3次亚克隆后制备了1株稳定分泌抗NSP8蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。分泌的单克隆抗体亚类鉴定其重链为IgG1型,轻链为κ链;杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200。Western blotting试验结果表明该单克隆抗体能识别原核及真核表达的NSP8重组蛋白。利用截短表达的方法对NSP8蛋白进行抗原表位的鉴定,初步确定了单克隆抗体针对的抗原表位序列为31SPQILKQLTKAFNIAKSDFEREASV55。本研究制备的单克隆抗体及对抗原表位的鉴定,为TGEV NSP8蛋白相关功能的研究奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用猪传染性胃肠炎（TGEV）华毒株弱毒H－155代感染iBRS2传代细胞，通过冻融、PEG6000沉淀、蔗糖密度梯度离心提纯制备的TGEV抗原，免疫BALB／C小鼠，取血清抗体阳性的免疫鼠的脾细胞，在50％PEG4000作用下，与SP2／0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，产生杂交瘤，用ELISA间接法对杂交瘤细胞生长孔上清液进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞株。通过有限稀释法进行3次克隆，获得了2株分泌抗TGEV的单克隆抗体杂交瘤细胞株，并对其所分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类、特异性、中和反应性等特性作了初步鉴定。     

猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的:建立抗血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP-1)脂多糖(LPS)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法:腹腔注射APP-1标准株的甲醛固定抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清中LPS抗体滴度并选择值最高的小鼠用于细胞融合,且于融合前3天加强免疫1次。常规方法进行融合,HT、HAT培养液选择培养融合后的细胞,ELISA检测细胞培养上清中的LPS抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆传代。结果:获得2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其小鼠腹水单克隆抗体效价132000～164000。结论:已成功建立2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫胶体金分型诊断技术奠定基础。     

禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研究

禽传染性支气管炎云分离株，经鸡胚增殖、密度梯度离心提纯后，制成佐剂抗原，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，应用ＥＬＩＳＡ监测小鼠地ＩＢＶ的应答能力。在ＰＥＧ－６０００（聚乙二醇）的作用下，小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。对分泌抗体阳性较强的杂交瘤细胞。应用有限稀释法克隆３次以上。获得９株抗ＩＢＶ阳性杂交瘤细胞，其中７株能稳定分泌抗ＩＢＶ单克隆抗体。初步应用研究表明，该７株杂交瘤细胞所和的单克隆抗体，不但能区分ＩＢ     

马绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

本研究采用马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin,eCG)纯品免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1∶10融合,间接酶联免疫吸附法(ELISA)筛选阳性克隆和有限稀释法克隆,扩大培养后于小鼠腹腔制备腹水,共得到8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA测定抗体效价,效价均达10^-5以上。用获得的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,为eCG分泌水平的ELISA检测方法的建立确立了条件。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用猪传染性胃肠炎(TGEV)华毒株弱毒H-155代感染iBRS_2传代细胞,通过冻融、PEG3000沉淀、蔗糖密度梯度离心提纯制备的TGEV抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清抗体阳性的免疫鼠的脾细胞,在50％PEG4000作用下,与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,产生杂交瘤。用ELISA间接法对杂交瘤细胞生长孔上清液进行检测,筛选阳性杂交瘤细胞株。通过有限稀释法进行3次克隆,获得了2株分泌抗TGEV的单克隆抗体杂交瘤细胞株。并对其所分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类、特异性、中和反应性等特性作了初步鉴定。     

抗猪SIgA单克隆抗体的研制

采用饱和硫酸铵盐析、SephadexG-200柱层析和离子交换柱层析技术，从猪初乳中提纯分泌型IgA(SIgA)。经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的SIgA达到电泳纯。以此纯化的SIgA，采用长程免疫法免疫BALB／c小鼠，取4次免疫后的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合，第1次融合率为79．7％，第2次融合率为60．3％。建立间接ELISA，用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体．初检阳性率分别为4．1％、16．8％。经2次亚克隆反复筛选获得了2株能稳定分泌抗猪SIgA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为CA6、5D4。ELISA和Western-blotting证实，所获得的单抗能特异性针对SIgA。CA6、5D4经反复冻存、复苏及多次传代，仍能分泌高效价抗体．CA6分泌抗体属IgM、κ型，而5D4分泌抗体属IgG1、κ型。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定

用纯化的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)免疫Balb／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术．取脾细胞与NSn骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到1株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株：6Pg。经鉴定，该单抗为IgG1亚类，杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条，杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1：256和1：20480。经Western-blot鉴定为针对N蛋白的单抗。6Pn株单克隆抗体与伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应，显示出良好的特异性。连续培养20代后能稳定分泌抗体。此单克隆抗体的获得为PRRSV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus, RVA)VP6基因节段，并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4 096 000,能够与不同基因型的RVA反应，同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应，为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

乙肝表面抗体和抗人红细胞单克隆抗体的F(ab′)_2偶联与鉴定

制备人红细胞非凝集型单克隆抗体,形成双功能抗体试剂,用于临床诊断。用人O型红细胞膜蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,制备非凝集型单克隆抗体,通过化学偶联法将非凝集性单克隆抗体和乙肝表面抗体的F(ab′)2片段偶联,制备出双功能抗体,用直接凝集法检测乙肝表面抗原。获得5株分泌非凝集型杂交瘤细胞,利用戊二醛一步法制备出双功能抗体,形成全血凝集检测试剂,并进行了初步鉴定。     

犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。     

蓝舌病病毒单克隆抗体的研究 Ⅰ.杂交瘤细胞的建立

用小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与经篮舌病病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞进行融合,产生杂交瘤细胞。以免疫荧光(间接法)和ELISA(间接法)进行杂交瘤抗体分泌检测,用有限稀释法进行3次克隆,获得5株抗体分泌稳定、产量高的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

IL-17单克隆抗体的制备与鉴定

为制备山羊IL-17单克隆抗体,诱导重组菌rIL-17-pET32a-TransB(DE3)表达山羊IL-17重组蛋白(rIL-17),纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆细胞株。对获得的杂交瘤细胞进行染色体组型分析,并对其分泌的IL-17单克隆抗体进行抗体特异性、抗体类别等分析。结果显示,成功获得了纯化的山羊IL-17原核表达产物;筛选到1株能特异性分泌山羊IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株-B6,其分泌的单克隆抗体亚型为IgG1,抗体轻链为κ。