PRRSV、CSFV与SIV三重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)与猪流感病毒(SIV)三重RT-PCR方法,根据Gen Bank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的RT-PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp(PRRSV)、530 bp(CSFV)和981 bp(SIV)。通过试验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV、CSFV和SIV的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-2、8.3×10-2和3.7×10-2ng。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有力手段。     

一步法RT-PCR同时检测CSFV和PRRSV方法的建立及应用

猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害云南养猪业的传染病,为了建立一种能快速诊断猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的方法,根据NCBI上已发表的猪瘟病毒(CSFV)保守基因Erns和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守基因M基因的核苷酸序列,利用Oligo 6.0设计了2对特异性引物,经过PCR反应...     

CSFV与PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的RT-PCR方法,根据CSFV和PRRSV的保守区域各设计1对特异性引物,预期扩增片段大小分别为356和546 bp,通过对反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,建立了CSFV和PRRSV的双重RT-PCR方法。结果显示:该方法能特异检测CSFV和PRRSV的cDNA最低量分别为0.96、1.48 ng,而对猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒(PCV)检测结果均为阴性;利用建立的双重RT-PCR对云南省部分地区送检的174份疑似CSFV及PRRSV感染的病料进行检测显示,CSFV感染率为24.14%,PRRSV感染率为47.70%,CSFV与PRRSV的混合感染率为16.67%,检测结果与单一RT-PCR结果相一致,且具有良好的可重复性;利用免疫组织化学方法对部分检测结果加以验证,验证结果与检测结果均一致。本研究成功建立了CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法,为二者的快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效手段。     

多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法.2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况.检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212).应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析.结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%～100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%～99.5%和86.4%～87.7%.推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变.12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同.     

多重荧光RT-PCR技术检测猪流感病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

[目的] 建立能同时鉴测猪流感病毒（SIV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重荧光RT-PCR方法。[方法] 根据4种病原体的高度保守基因序列,设计相应引物和探针,并对引物和探针浓度进行优化,检测48例疑似样本。[结果] 建立了多重荧光RT-PCR方法,检测48例临床样本中,4种病毒均未感染的1例,SIV与JEV混合感染占2.1?%,CSFV与PRRSV混合感染为31.3?%。[结论] 多重荧光RT-PCR对四种病原体的检测准确性好,具有快速的特点。     

CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV多重qRT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列特点,设计3对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪的其它常见病毒无交叉反应;对CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV3种重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。试验表明,研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

CSFV、PRRSV和PCV2多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的多重PCR,参照GenBank中发表的3种病毒的基因序列,针对猪瘟病毒的E2、猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF7和猪圆环病毒2型的ORF2等基因,分别设计出3对特异引物,通过优化反应条件,建立了同时检测3种病毒的多重PCR,该PCR可同时扩增出204 bp(猪瘟病毒)、314 bp(猪繁殖与呼吸综合征病毒)和485 bp(猪圆环病毒2型)的目的条带,猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪流行性腹泻病毒的扩增结果为阴性。选取96份疑似有繁殖障碍病的母猪,采集病猪血清样品进行检测,其中感染2种以上病毒的样品比例为34.3%(33/96)。结果表明,多重PCR与单一PCR的符合率为100%,该方法可用于猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型等病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

CSFV与PRRSV检测方法的建立及应用

构建同时检测CSFV与PRRSV检测方法,通过多重PCR方式进行检查,其符合率高达100%;此种方法在猪瘟病毒以及猪繁殖与呼吸综合征病毒检验中效果显著,是一种有效的方法手段.基于此,文章主要对CSFV与PRRSV检测方法的建立及应用进行了简单的分析研究.     

CSFV、PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及其应用

由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(Ec.oli)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法.通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490 bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒和组织毒、田间样品及临床症状相似的疾病猪瘟和猪伪狂犬病毒做了检测;并对田间及实验室样品进行符合率试验,对阳性样品进行重复性试验.与常规RT-PCR法进行比较,证明该方法比常规RT-PCR法敏感性提高了10倍;而且利用该方法可使检测时间大大缩短;特异性试验证实该方法无交叉反应;阳性和阴性样本的符合率均为100％;3次阳性样品重复性检测结果完全相同;稳定性试验显示该试剂盒至少可保存1年以上.本研究所建立的PRRSV一步多重RT-PCR检测方法的敏感性高、特异性强、操作简便、省时、结果重复性好,不仅适用于临床病例尤其低微含量样品的诊断,而且在筛查隐形带毒动物及兽医检疫方面具有重要的应用价值.     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508 bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338 bp/248 bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614 bp片段.经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法.该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL.对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77 ％(4/106);CSFV阳性7份,占6.60％(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04 ％(17/106).结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查.     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

PRRSV、CSFV和JEV混合感染的多联PCR诊断

通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒等的基因序列分析,设计多联PCR诊断方法诊断发病猪场上述病毒的混合感染,发现单病毒感染率在68．79／6～81．5％之间,混合感染率在58．9％～90％之间。采取的防制措施是研制和普遍使用新型疫苗,严防病原体传入,扑杀危险患病猪只,封闭式饲养等综合性措施,获得了较好的效果。     

江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法，对2005～2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果，PRRSV阳性率为51．2％，PCV2阳性率为44．1％，CSFV阳性率为10．4％，PPV阳性率为3．9％，PRV阳性率为2．4％。2005年病料中PCV2阳性率为21．2％，2006年为73．2％；2005年PRRSV阳性率为38．1％，2006年为67．7％。2006年猪高热病疫情比2005年严重，PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明，2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×10~4拷贝/μL、3.13×10~3拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100%。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.