微卫星标记在鱼类遗传及育种研究中的应用

微卫星标记在鱼类遗传多样性、种群遗传结构分析、基因组作图等方面的研究中发挥着较大的作用,并逐渐应用到鱼类分类、亲本鉴定及资源保护与育种等工作中。     

鲤鱼三、四核苷酸重复微卫星座位的筛选及特征分析*

采用磁珠富集法结合放射性同位素杂交法分离出鲤鱼(Cyprinus carpio)三、四核苷酸重复的微卫星阳性克隆1248个。对其中的384个克隆进行测序分析,共得到微卫星序列325个,其中完美型244个（75.08%）,非完美型59个（18.15%）,混合型22个（6.77%）。依据得到的微卫星序列,用Primer 3软件在线设计并合成引物145对,检测结果显示71.43%（80对/112对）的引物在野生个体间表现出多态性,等位基因数在3~12之间,多态信息含量在0.2109~0.8607之间,80%的位点处于高度多态水平。对群体的遗传结构评估结果显示,四核苷酸重复的微卫星标记在黑龙江鲤野生群体表现出的多态性水平（PIC=0.7740）高于三核苷酸重复（PIC=0.5161）和双核苷酸重复（PIC=0.49）,适用于群体间遗传差异分析和遗传连锁图谱的构建。     

松树、杨树及桉树表达基因序列微卫星比对分析

微卫星是生物基因组中变异频率最快的序列,结构基因中微卫星重复数的变化会引起基因的框移突变,导致基因表达完全不同或截短的蛋白。因此在进化过程中,基因区微卫星会受到强烈选择的影响。为研究基因区微卫星在不同树种中的变化情况,在本研究中,利用SPUTNIK程序分析了NCBI数据库中松树（Pinus spp.）、杨树（Populus spp.）及桉树（Eucalyptus spp.）的表达序列标签（express sequence tag,EST）序列各3万条。结果显示,桉树和杨树EST序列含有微卫星的比例比较接近,分别为18.7%和15.3%,而在松树中则发生了较大分化,只有8.2%。研究发现,三碱基重复单元是这3个树种编码序列中微卫星的主要重复类型。除三碱基重复微卫星外,桉树和杨树EST序列中其它类型微卫星的丰度随着重复单元长度的增加而减少,而在松树中则呈相反现象。同时值得注意的是松树EST序列中变异频率快的微卫星（〉20bp）数量明显比桉树及杨树少。研究还发现,3个树种中微卫星获得或丢失重复单元的速率都随着重复单元的增加而降低。本研究首次报道了不同树种基因区微卫星比较研究,发现了一些松树与杨树、桉树相比较EST序列中所含微卫星在丰度及变异频率方面存在的异同。基因所含微卫星序列对基因的功能有重要影响,本研究的结果将为了解不同树种中基因区微卫星的特征提供重要参数,同时也将为利用所研究树种的EST序列开发多态性高的微卫星标记提供有益的生物信息学参考。     

鲍分子遗传学研究进展

阐述了近年来鲍分子遗传学方面的研究进展,总结了核型分析、等位酶、微卫星和小卫星、随机扩增多态性DNA、限制性片断长度多态性、线粒体DNA、表达序列标签研究和基因序列等技术在鲍种群遗传多样性、遗传分化、遗传结构及种质鉴定等方面的应用。并指出今后应加强鲍蛋白质组学、功能基因组学、遗传连锁图谱、数量性状基因座和标记辅助选择等方面研究。     

微卫星在蜜蜂研究中的应用

微卫星是一类DNA标记 ,包括 1～ 5个核苷酸的不同数目串联重复。通过PCR扩增 ,可以获得不同等位基因微卫星侧翼序列之间准确的碱基长度。微卫星具有高的突变率 ,所以形成大量等位基因 ,使其特别适合于构建基因图谱或进行父权分析。作为共显性标记 ,可以用来进行群体遗传学研究     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)微卫星DNA的筛选与引物设计

皱纹盘鲍(H aliotisdiscushannai)隶属腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目。近年来国外学者已相继开发日本盘鲍(H aliotis-discusdiscus)、H.rubra、H.asinina和H.kam tschatkana的微卫星标记并已应用于亲缘关系鉴定、种群多样性研究(Selva-m anietal.,2001;C onod etal.,2002)。国内对鲍鱼基因组的研究甚少,李琪(2000)分离出8个皱纹盘鲍微卫星标记。根据本实验室建立的微卫星克隆方案对皱纹盘鲍微卫星D N A进行筛选和引物设计,为进一步的种群遗传分析和物种多样性鉴定提供基本资料。1材料和方法1.1皱纹盘鲍部分基因组文库的构建实验所用的皱…     

致病疫霉基因组微卫星标记开发

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害.通过致病疫霉基因组开发微卫星标记,旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记.利用软件SciRoKo和ClustalX对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选.然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物,选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测.最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估,然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析.共获得了33个具多态性的微卫星标记,占开发总数的28.7％,其多态信息含量(PIC)值都在0.164～0.614之间,其中PIC≥0.5的标记有7个,0.25 ＜PIC＜0.5的标记有25个,PIC≤0.25的有1个.发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性,与甲霜灵敏感性不相关.本研究开发出一批具有多态性微卫星标记,为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高,稳定性强的分子标记.     

马铃薯X病毒完整基因组上微卫星分布

本文利用自编计算机程序提取并展示马铃薯X病毒完整基因组（NC_011620.1）上微卫星分布特性。借助MATLAB软件和借用最优完全子图算法,分析NCBI数据库中该基因组（NC_011620.1）微卫星分布特性。结果表明,计算出所有各种N-碱基组（N取1至6）在完整基因组序列上重复出现次数和出现位置,展示它们的分布规律（指数函数）,马铃薯X病毒完整基因组（NC_011620.1）上各种N-碱基组最大的重复出现次数随N按指数函数数减少;且呈现出重复出现次数由少到多排序,重复出现次数随序号增加;本文使用的方法,可以系统地应用到其它病毒完整基因组序列微卫星分布特性分析,从而为有效利用微卫星分布特性研究完整基因组的结构和功能、遗传和变异规律提供完整的数据支撑。     

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。     

黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析

通过磁珠富集法首次筛选黄颡鱼微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7进行微卫星片断的富集,挑选部分阳性克隆测序获得38个含有微卫星的DNA序列,总计设计并合成了22对微卫星引物。以普通黄颡鱼基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记,每对引物等位基因数2-8个（平均3.78）,遗传杂合度0.2225-0.8101（平均0.5755）,多态信息含量0.3425-0.7900（平均0.5336）。此外18对多态性微卫星引物中有16对在黄颡鱼属其它4种鱼类具有通用性,13对在鲇形目中的3种鱼类具有通用性。因此,可以推断筛选的多态性微卫星标记可用于黄颡鱼属和鲇形目鱼类的遗传分析。     

我国荷斯坦种公牛个体识别和亲子鉴定DNA数据库的建立

为了构建我国荷斯坦种公牛个体及亲子鉴定DNA数据库,本研究从联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的具有高度多态性的微卫星标记中选取11个常染色体微卫星标记(BM1824、BM2113、ETH、ETH10、ETH225、INRA023、SPS115、TGLA53、TGLA122、TGLA 126和TGLA227)以及4个自逸的Y染色体微卫星标记(MAF45、MCM158、UNM0108和UMN0929),采用荧光引物PCR和ABI3130遗传分析仪,对2 150头荷斯坦种公牛(Bos taurus)个体基因型进行了检测,并探讨其用于牛个体识别和亲子鉴定的可行性.研究结果表明:15个微卫星标记平均杂合度为0.766,平均多态信息含量为0.738,其中MCM158标记平均多态信息含量最高为0.866,SPS115标记最低为0.588,均属于高多态性标记.15个标记累积个体识别能力为99.99％,累积非父排除率达到99.99％,随机个体一致性概率为1.62×10-17.研究结果表明上述15个微卫星标记进行个体识别和亲子鉴定的效力与可靠性均很高,同时初步建立了荷斯坦种公牛DNA数据库.从而使个体识别和亲子鉴定程序标准化、统一化和简便化.     

14个微卫星DNA标记在猪个体识别和溯源中的应用研究

本研究应用微卫星标记对3个国外引进猪品种(大白猪、长白猪和杜洛克猪)进行了个体识别的可行性研究.每个品种选取同窝的10个个体,利用SSR多态性分析个体之间的差异.结果表明利用7个微卫星标记即可区分来源于其中2窝的20个个体,再加上7个微卫星标记后可对另一窝10个后代进行个体识别.本研究进一步利用这些微卫星标记对屠宰场随机取样的5头猪进行从肉样到血液样品的溯源研究,结果表明同一头猪的肉样和血液样品的微卫星座位是一一对应的,说明应用微卫星标记进行从市场肉品到养殖猪血液的DNA溯源是可行的.     

鸭微卫星标记的筛选及其遗传多样性分析

采用磁珠富集法从AFLP片段中筛选微卫星标记,并对5个福建地方鸭品种的遗传多样性进行检测。基因组DNA用EcoRⅠ/MseⅠ内切酶酶切的同时与接头连接,酶切连接产物与用生物素标记的探针杂交,应用磁珠捕获100~2000bp含有微卫星序列的DNA片段并通过pGEM-T载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中,构建富集微卫星序列的基因组文库。随机挑选46个阳性克隆,测序获得14条含有微卫星的DNA序列并递交到GenBank（登录号：FJ599499~FJ599512）。设计合成14对微卫星引物,通过PCR优化从中选择5对引物用于5个福建地方鸭品种的遗传多样性分析。结果显示,5对微卫星引物共检测到31个等位基因,各微卫星基因座的有效等位基因数为1.969 7~2.834 4,多态信息含量和杂合度的平均值分别为0.5133和0.7480,遗传多样性丰富,说明磁珠富集法适合用于鸭微卫星标记的分离与筛选,筛选得到的5个微卫星位点可作为有效的遗传标记用于福建省地方鸭品种遗传多样性的研究。     

磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记

通过磁珠富集法筛选白鲢（Hypophthalmichtys molitrix）的微卫星分子标记.从血液中提取白鲢大片段基因组DNA,限制性内切酶Sau3AI部分消化,使大部分片段介于400～900bp,低熔点琼脂糖凝胶回收.在筛选的基因组片段上连接1个20bp的双链接头,构建白鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针（CA）15进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,得到一个微卫星序列文库;又经同位素标记的微卫星探针（CA）15进行第2次筛选,获得149个阳性克隆,经测序分析,获得微卫星序列138个,这可用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计引物81对.     

绿色豌豆蚜不同地理种群的遗传多样性

豌豆蚜是我国苜蓿上危害最为严重的害虫之一。利用微卫星标记研究了我国绿色型豌豆蚜10个地理种群的遗传相似性、基因分化、遗传距离与地理距离和海拔之间的关系及其基因结构。选取15对引物扩增300个个体,共检测到41个多态性条带,多态性条带百分率(PPB)为100%。10个豌豆蚜地理种群观测等位基因数(Na)为1.592 7,有效等位基因数(Ne)为1.356 9,Nei’s基因多样性指数为0.206 6,Shannon-Wiener指数(I)为0.307 6。新疆维吾尔自治区、陕西省、河南省种群的遗传多样性较高,内蒙古自治区、山东省、青海省种群相对较低。然而,10个地理种群豌豆蚜(绿色型)的遗传分化较高(Gst=0.399 6)。种群聚类分析结果显示,全部豌豆蚜种群明显聚为两大类群,山东省、河南省种群为一大类群,其余为另一大类群。Mentel检测表明,遗传分化与地理距离、海拔无显著相关性。我国豌豆蚜种群具有非常丰富的遗传多样性,应加强豌豆蚜的监测和治理。     

苹果EST中微卫星分析

利用MISA（microsatellite）软件分析了简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）在苹果EST中的分布频率与密度。结果表明,在263820条EST序列中,共获得160686条SSR序列,SSRs之间的距离约为0．79kb。其中,六碱基重复丰度最大,占57．2％,而单碱基、三碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14．5％,13．1％,10．1％,4．1％和1．0％。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A／T,AG,AAG和AAAG,而CG在编码区内丰度很低。用CAP3软件进行冗余分析表明,在这六种类型的重复模体中,冗余与非冗余的苹果EST之间没有显著差异,表明可从现有的ESTs数据中方便地获取有效的苹果微卫星标记。     

鲮微卫星DNA分子标记的筛选与遗传多样性分析

采用磁珠富集法对已建立的生长较快的西江段野生浅色鲮群体的极大、极小群体各31尾基因组DNA进行了微卫星序列的筛选,128个阳性克隆成功测序93个,其中80个为的微卫星序列,微卫星序列完美型占85％,非完美型占6．25％,混合型占8．75％。利用微卫星序列合成了23对微卫星引物,扩增结果表明,等位基因数为1～10个,扩增片段大小为92～283bp,其中14对引物扩增条带清晰,为中度或高度多态位点,极大、极小群体的平均有效等位基因数和平均多态信息含量分别为3．0784、3．2079和0．5675、0．5974,反映出2个群体遗传多样性均较丰富;高度多态性引物4的位点b,片段大小为119bp,在极大群体中出现频率为61．3％,在极小群体占22．6％,出现频率极大群体高于极小群体近3倍,初步可作为候选差异性分子标记。     

微卫星标记分析广西水牛遗传多样性

为研究广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)核基因组的多态性,采用23对荧光标记微卫星引物,对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测。结果表明,23对引物中,有19对可以获得特异性产物且存在多态,平均有效等位基因数为4.0189,基因座ILSTS086含有13个等位基因;各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852~0.4722,ILSTS019基因座平均杂合度最高(0.4722),而ILSTS017平均杂合度最低(0.1852);群体基因平均多态信息含量(PIC)为0.6639,19个标记中有18个PIC大于0.5,属高度多态位点。     

植物转座元件及其分子标记的研究进展

转座元件是基因组中可移动的DNA分子，在真核生物的基因和基因组进化中起着重要的作用。植物的转座元件分为反转录转座子和DNA转座子两大类，其中，反转录转座子又分为长末端重复序列(LTR)反转录转座子和非LTR反转录转座子两个亚类，而DNA转座子分为自主元件、非自主元件和微型反向重复转座元件(MITE)三种类型。基于植物转座元件的分子标记目前主要有序列特异扩增多态性(S-SAP)、MITE显示、转座子显示(TD)、MITE位点间多态性(IMP)、反转录转座子位点(IRAP)、反转录转座子-微卫星扩增多态性(REMAP)和基于反转录转座子插入多态性(RBIP)。综述了这些分子标记技术的原理及其在生物遗传多样性与系统进化分析、基因作图、品种鉴定等方面的应用。     

利用微卫星DNA分子标记分析中华绒螯蟹养殖群体遗传分化

养殖河蟹苗种来自各繁育场,经过繁育场多年封闭或半封闭繁育后河蟹多样性是否降低?本研究以长江水系天然群体为对照,利用微卫星分子标记分析中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)江苏兴化、安徽宣城、辽宁盘锦养殖群体遗传分化。结果表明,4个群体平均有效等位基因数(Ne)分别为9.03、8.77和6.94、8.71;平均观测杂合度(Ho)为0.70～0.75;平均期望杂合度(He)为0.87～0.90;微卫星位点平均多态信息含量(PIC)介于0.84～0.87之间,呈现高度多态性;长江水系天然群体遗传多样性水平高于养殖群体。遗传分化系数F-统计量(FST)介于0.0123～0.0207(FST<0.05);分子方差分析(AMOVA)显示,大部分遗传变异(为98.64%)存在于个体间,少部分变异(为1.36%)存在于群体间。群体间FST和AMOVA分析说明,4个群体处于低等遗传分化水平,除安徽宣城群体与辽宁盘锦养殖群体间遗传分化不显著(P>0.05),其他群体间遗传分化极显著(P<0.01)。基于DA遗传距离构建NJ聚类发现安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体聚为一支,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体聚为另一支。结构分析107份参试中华绒螯蟹样本被分为二个种群,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体属同一种群,安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体为另一种群。研究显示,中华绒螯蟹养殖群体具有较高的遗传多样性水平,遗传分化水平低,具有新品种选育的利用价值。