马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

根据正交试验设计原理,设计探索正交试验和细调正交试验以确定马蔺(Iris lacteal Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz)ISSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg²⁺4种因素对马蔺ISSR反应体系进行了优化,得到适合马蔺的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有dNTP 0.3 mmol/L、Taq酶1.5 U、Pri mers 0.4μmol/L、Mg²⁺2.5 mmol/L以及1×buffer和50 ng模板DNA。通过对马蔺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为52℃。这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究马蔺遗传多样性奠定了基础。     

红三叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验设计,对影响红三叶ISSR-PCR反应较大的4个因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4个水平上进行筛选,建立并优化了适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25μL反应体系中各反应物的最适含量为40ng模板DNA,10×PCR-buffer 2.5μL,2.5 mmol/L Mg2+,2.5UTaq DNA聚合酶,引物1μmol/L,0.2mmol/L dNTP。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,引物退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。     

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTP(2.5mmol/L),1.5μL引物(10pmol/μL),50ng模板DNA,ddH2O补足体积。以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃。12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81%。     

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选     

正交设计优化黑褐苔草ISSR-PCR反应体系

采用正交设计对黑褐苔草（Carexa trofusca）ISSR-PCR反应的Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板进行优化,以期建立最佳反应条件并筛选退火温度。结果表明：黑褐苔草20μLISSR-PCR最佳反应体系为：1.80μmol·L^-1 Mg²⁺、0.60 U Taq DNA聚合酶、0.125μmol·L^-1 dNTP、0.3μmol·L^-1 Primer和50ngDNA模板;引物UBC807适宜退火温度为55℃。该体系能在不同个体中扩增出清晰的、稳定性好的条带。     

结缕草属植物ISSR-PCR反应体系研究

以SDS法提取的结缕草(Zoysia spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg²、dNTP、引物和DNA聚合酶并通过比较不同浓度的模板DNA对PCR扩增的影响,确立结缕草属植物ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同浓度对PCR反应结果有显著影响,正交设计可以用于ISSR反应体系建立,该方法建立的结缕草属植物ISSR-PCR优化反应体系为10X Buffer7、0 ng模板DNA、Mg²+2.0 mmol·L^-1、dNTP 150μmol·L^-1、Primer 0.3μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL;经对11份结缕草属植物进行检验,证明该体系稳定可靠。该体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析等提供依据。     

灰色家鸽ISSR反应体系的建立与优化

本研究旨在通过正交优化得出灰色家鸽的ISSR-PCR反应的最佳体系。以灰色家鸽为试验材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择,建立了适合灰色家鸽的ISSR-PCR分析的最佳体系。结果表明,灰色家鸽ISSR-PCR反应的最优体系为:25 μL总体积中包括10×PCR Buffer 2.5 μL, Mg²⁺ 2.6 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, 引物0.4 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,DNA 模板1.2 ng/μL,最佳退火温度为56.2 ℃。通过对ISSR-PCR反应体系的优化,能为利用该技术进行灰色家鸽遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析奠定基础。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol·L^-1dNTP,0.5μmol·L^-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol·L^-1MgCl₂;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

假俭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以假俭草为材料,对影响ISSR—PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草ISSR—PCR分析的最佳反应体系。表明在20弘L总体积中,包含40ng模板DNA、ISSR引物0．4umol／L、dNTPs0．1mmol／L、Mg^2＋1．0mmol／L、0．1U TaqDNA聚合酶和10×buffer 2．0uL。扩增条件为．94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1．5min,35个循环;72℃延伸7min。     

克氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对克氏针茅ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA、Mg2 、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,确立了适合克氏针茅ISSR分析的优化反应体系。在25μL反应体系中各反应成分为:模板DNA 50 ng,Mg2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,10×buffer 2.5μL。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行克氏针茅遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以内蒙古呼和浩特市近郊野生马蔺DNA为模板,采用均匀设计,通过5因素5水平和5因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度等)进行优化筛选,建立了适合马蔺的最佳ISSR-PCR反映体系:在25μl反应体系中,包括2.5μl 10×PCR Buffer、2.0mmol/L Mg2+、2.5μmol/L dNTP、1μmol/L引物1、.5U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA。在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性3min;然后进行40个循环(94℃变性45s,52.3～60.5℃退火30s,72℃延伸1.5 min);循环结束后,72℃延伸5min。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+, dNTPs,引物, Taq DNA 聚合酶及DNA 模板浓度进行优化。结果表明,适于杨桃研究的SCoT-PCR最佳反应体系为：总体积为20μL的反应体系中,含2.5mmol/L Mg2+,0.3mmol/L dNTPs,30mg/L模板DNA,1.00μmol/L引物和0.4U Taq DNA聚合酶。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

本氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立及引物筛选

以CTAB法提取的本氏针茅(Stipa bungeana Trin.)基因组DNA为模板,采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对影响本氏针茅ISSR-PCR反应体系中的DNA、Taq酶、dNTPs、引物和Mg2+进行优化,旨在建立适合本氏针茅ISSR-PCR分析的最佳反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中各组分的浓度分别为:DNA(20ng/μL)2.5μL、Taq DNA酶(5U/μL)0.1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、引物(10μmol/L)2.3μL、Mg2+(25mmol/L)1.4μL、10×Buffer 2.5μL、ddH2O 9.6μL。经过体系验证和引物筛选试验表明该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立为本氏针茅种质资源遗传多样性研究提供了理论基础。     

土鳖虫ISSR-PCR反应体系的建立及优化

<正>药用土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)或冀地鳖(Steleophaga plancyi(Boleny))的雌虫干燥体[1],临床上广泛应用于高脂血症、血栓性疾病和心脑血管缺血等疾病的治疗。目前,缺乏对不同种质的土鳖虫进行系统评价的方法,因此在分子水平上开展对土鳖虫的种质资源研究对于土鳖虫种质资源的合理开发和利用具有重大意义。     

家蚕5龄幼虫蛋白水解酶的最适反应温度和pH值

调查了家蚕(华峰×雪松)5龄幼虫的血液、消化液以及脂肪体蛋白水解酶的反应条件,发现其最适反应温度均在37℃左右,最适反应pH分别为80、98和68左右。血液蛋白水解酶在pH68~98之间其活力变化不大。     

绵羊瘤胃微生物CMCase酶促反应最适条件研究

试验系统地测定了绵羊瘤胃微生物细胞内和细胞外羧甲基纤维素酶(CMCase)酶促反应的最佳条件,包括最适pH值、底物用量、酶量、反应时间和反应温度。结果发现:当pH值介于4.5～6.0之间时,CMCase活力无显著差异,其中胞外CMCase在pH值为5.5时活力最高,胞内CMCase在pH值为5.0时活力最高;随着底物用量的增加,酶活力极显著增加(P<0.01),并在10mg时达到最大值;酶量在0.25ml时,胞内CMCase活力达到最大值,而胞外CMCase则在0.5ml时最高;随着反应时间的延长,CMCase活力均逐渐下降,无论是胞外还是胞内CMCase,反应10min时即达到最高活力,且在胞外同其它组比较差异极显著(P<0.01),在胞内显著高于反应30～60min时的活力;胞内和胞外CMCase活力均在45℃时最高。