猪PRLR基因多态性及其与产仔性能的关联分析

旨在检测猪PRLR基因第10外显子的多态性及其对产仔性能的影响。采用PCR-RFLP技术检测大白猪、马身猪、山西黑猪和山西白猪4个品种（系）221个个体PRLR基因第10外显子的多态性,并采用单变量动物模型分析多态位点对母猪产仔性能的影响。结果表明,PRLR基因第10外显子存在NaeⅠ多态位点。在4个猪种中均检测到A、B 2个等位基因和AA、AB 2种基因型,等位基因A为优势等位基因,频率在0.86~0.93之间。该位点对母猪产仔性能有显著影响,AA型母猪的头胎产仔数和产活仔数分别比AB型高1.797和1.293头,达显著水平（P〈0.05）。因此,将该位点作为遗传标记应用于种猪选择中,可能会有利于猪繁殖性能的提高。     

嵊县花猪PRLR基因多态性与繁殖性状的相关分析

应用PCR-RFLP技术检测嵊县花猪PRLR基因第10外显子NaeⅠ酶切位点多态性，并采用SPSS13．0统计软件分析该位点多态性对母猪繁殖性能的影响。结果表明，该位点多态性对头胎、第3和第10胎母猪繁殖性能有显著影响，表现为第1胎AA型母猪产活母仔数和断奶母仔数比AB型母猪多1．68头和1．60头；第10胎AA型母猪产活仔数、活母仔数和断奶母仔数比AB型母猪分别多0．91头，1．67头和1．19头；而第3胎AB型母猪产活仔数、活母仔数和断奶母仔数比AA型母猪分别多1．09头、1．19头和1．05头。     

Evaluation of Prolactin Receptor (PRLR) as Candidate Gene for Male Fertility in Hanoverian Warmblood Horses

Stallion fertility has increasing importance as the artificial insemination is employed in horses more intensely. Molecular genetic markers may be useful tools to evaluate the stallion fertility before breeding. The prolactin receptor gene (PRLR) was chosen as a candidate for stallion fertility because of its influence on testicular and accessory sex gland function. Screening the equine PRLR gene for polymorphisms in Hanoverian stallions revealed two single nucleotide polymorphisms (SNPs). Association and haplotype analyses were performed in 162 Hanoverian warmblood stallions for these intragenic SNPs using the least square means (LSM) of the pregnancy rate per oestrus for stallions and the paternal component and embryonic component of the breeding values (BV) of the pregnancy rate per oestrus. The two SNPs (BIEC2‐589441, BIEC2‐560860) showed significant associations using single marker and haplotype analysis with the embryonic and paternal component of BV and one SNP (BIEC2‐560860) was also significantly associated with the LSM of the pregnancy rate per oestrus. This is the first report on an association of PRLR‐associated genetic markers with fertility traits in stallions.     

牛催乳素受体(PRLR)基因HinfⅠ多态性与奶牛生产性能相关性研究

采用PCR-RFLP方法检测了牛催乳素受体（PRLR）基因intron 8多态性。结果表明：中国荷斯坦牛、加拿大荷斯坦和澳洲荷斯坦牛群体中HinfⅠ酶切后均有A和B两个等位基因存在。利用最小二乘分析研究了该多态位点对奶牛305 d产奶成年当量、乳脂肪率、乳蛋白率、初次配种日龄和初次产犊日龄的影响。结果表明：不同基因型个体的乳脂率、初次配种日龄和初次产犊日龄的差异均未达到显著水平,但呈现出AA〉AB〉BB的趋势。BB型个体的305 d成年当量与AA型、AB型个体有显著差异（P〈0.05）,BB型个体的乳蛋白率与AA型、AB型个体有极显著差异（P〈0.01）。对305 d成年当量、乳脂肪率、乳蛋白率、初次配种日龄和初次产犊日龄A基因的加性效应分别为296.00 kg/胎次、0.08%-、0.14%、4.55 d/头、15.10 d/头,A等位基因的显性效应为259.80 kg/胎次、0.07%、-0.10%、0.95 d/头和4.90 d/头。     

西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析

为了研究不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因，利用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊泌乳60d乳腺组织及泌乳28d乳腺组织中差异表达基因文库，用Real-Time PCR技术验证阳性克隆血清淀粉样蛋白A3（SAA3）基因，通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织SAA3，并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库，筛选克隆了乳腺组织SAA3基因，GenBank登录号为：DQ839400，编码区长度为396bp，含有131个氨基酸。西农萨能羊乳腺组织中SAA3与牛（GenBank：NM_181016）、兔（GenBank：M64696．1）、人（GenBank：BC020795）、鼠（GenBank：NM_011315）核苷酸同源性分别为95％、84．3％、81.3％和81.9％，氨基酸同源性为93％、76％、72％、72％；在编码区261-287位较人、兔、鼠SAA编码区多27个碱基，连续大于5个氨基酸的保守区域有6个，较人SAA多3个潜在功能基序。     

松辽黑猪和长白猪催乳素受体基因第10外显子多态性与繁殖性状的关联分析

试验旨在探讨催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因遗传多态性及其与松辽黑猪、长白猪繁殖性状的关联性。采用PCR-RFLP方法对松辽黑猪和长白猪PRLR基因第10外显子进行了多态性检测,并运用最小二乘法分析各基因型对母猪繁殖性能的遗传效应。结果表明,两个猪种中都存在A、B 2个等位基因和AA、AB、BB 3种基因型,松辽黑猪和长白猪等位基因A的频率分别0.551和0.578,A为优势基因。两个猪种的AA基因型个体的断奶仔猪数、乳头数都显著高于其他两个基因型(P＜0.05),初产松辽黑猪AA基因型个体的TNB、NBA显著高于其他基因型(P＜0.05),对其他繁殖性状影响不显著,但呈现出AA＞AB＞BB的趋势。     

皖西白鹅催乳素受体基因表达特点的研究

采用荧光定量PCR法,研究了皖西白鹅催乳素受体基因(prolactin receptor,PRLR)在产蛋不同时期及生殖轴不同组织mRNA的表达特点。结果表明,在垂体、下丘脑和卵巢组织中,皖西白鹅产蛋前期PRLR表达水平较低,至产蛋期降至最低,抱窝期上升至极高水平,休产期再次下降至较低水平,且各组织均表现出相似的规律,但卵巢中的表达量相对较高;就巢期间,在就巢前、中、后期,PRLR mRNA表达量在各组织呈现不同的变化规律,垂体组织中表达量呈"V"形变化,在中期前下丘脑中PRLR mRNA维持稳定,到后期有所下降,卵巢中表达量呈梯形下降。PRLR mRNA表达量在不同周期及不同组织中的变化规律反应了PRLR对皖西白鹅就巢的影响,PRLR对鹅就巢的调控可能在转录时期已经开始。     

西农萨能羊泌乳高峰期和初期乳腺组织差异表达基因研究

利用抑制性削减杂交和实时定量PCR研究西农萨能羊泌乳高峰期差异表达基因,结果表明成功构建泌乳高峰期和泌乳初期乳腺组织差异表达削减eDNA文库,以GAPDH为指标检测文库削减效率为2^5倍,共获得78个阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150～1000bp,挑选插入片段不等的30个克隆测序,获得25个有效序列,代表18个基因。对文库中所包含的血清淀粉样蛋白A3（SAA3）,ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）,心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）和黄嘌呤脱氢酶（XDH）进行实时定量PCR检测,发现上述4个基因在泌乳高峰期乳腺组织中的表达水平分别是泌乳初期的17．0,7．7,16．3和1．7倍。结论：构建的消减文库可用于筛选泌乳高峰期差异基因,已鉴定的4个基因很可能是调控产奶量和乳成分变化的候选基因。     

铁对泌乳期小鼠乳腺中乳铁蛋白基因mRNA水平的影响

探讨铁对小鼠乳腺中乳铁蛋白(lactoferrin,LF)mRNA基因表达的影响。选取雌性昆明白小鼠40只,随机分成5组,按实验动物标准饲养,各处理组添加不同水平和来源的铁:硫酸亚铁(Fe0mg/kg)、硫酸亚铁(Fe60mg/kg)、硫酸亚铁(Fe120mg/kg)、甘氨酸铁(Fe120mg/kg)、甘氨酸铁 硫酸亚铁(Fe120mg/kg)。配种、产仔,于哺乳21d后处死取样,用相对定量RT-PCR方法,以β-actin作内标,测乳腺LFmRNA丰度。试验表明,不同来源和剂量的铁可不同程度影响LFmRNA的表达,甘氨酸铁(Fe120mg/kg)组较对照组差异达极显著水平(P<0.01)。因此,甘氨酸铁可显著提高乳腺中LFmRNA的表达量,作为有效铁补充剂的同时可能促进乳汁中LF的含量。     

人血清白蛋白基因乳腺表达载体在奶山羊乳腺中的瞬间表达

构建了包括人血清白蛋白 ( h ALB)基因的 c DNA全序列、内含子 1以及山羊β-酪蛋白基因启动子和 5′端上游调控序列在内的乳腺表达载体 pc DNA3.1 -GCALBm,采用直接注射法将其导入哺乳期的奶山羊乳腺组织 ,然后通过放射免疫法测定乳汁中 h ALB的含量。结果显示 ,5头受试奶山羊的乳汁中有明显的 h ALB表达 ,注射后第 2天放免测定值从注射前的 4 .0 mg/L左右分别上升至 62 .2、59.2、36.2、4 2 .3、1 7.5mg/L,并持续表达在 2周以上 ,其中 1头受试羊乳汁中 h ALB的表达量维持在 80 mg/L左右 ,并超过了 1 0 0 d。而在乳腺组织中注射 pc DNA3.1空质粒或生理盐水的 4头对照奶山羊的乳汁中 ,放免测定值无变化。     

乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展

乳蛋白是乳的主要营养成分，乳蛋白的种类及其在乳中的浓度都影响乳的品质，而乳中各乳蛋白的含量都受到相应乳蛋白基因的控制。通过转基因技术，可以在转基因动物乳腺细胞中特异性地表达目的蛋白，从而改善乳的品质以及生产具有特殊药用价值的乳产品。本文主要概述乳蛋白多态性及其作用，乳蛋白基因及多态性，并着重介绍乳蛋白基因在转基因动物体内的表达调控；通过介绍大量转基因试验的研究成果，以探寻改变乳成分的分子遗传基础。     

西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织差异基因的筛选

旨在利用抑制性削减杂交(SSH)技术筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和后期的差异表达基因,并用实时定量PCR(Q-PCR)分析差异基因的表达丰度,探讨奶山羊不同泌乳阶段乳腺组织的基因表达规律。本研究以西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织的mRNA互为检测子(Tester)和驱动子(Driver)构建cDNA消减文库(M-L和L-M),随机挑选克隆测序,进行序列比对分析,并检测部分差异基因在乳腺组织中的表达丰度。结果,成功构建了泌乳中期和后期的cDNA文库,随机挑选30个克隆测序,得到M-L和L-M文库中与细胞凋亡、抗氧化、脂类代谢、能量代谢等生理过程相关的差异基因,对其中的6个基因进行实时定量分析,发现5个均为阳性克隆,表达水平增加了1.3~5.5倍不等。结果表明,利用SSH技术成功构建了泌乳中期和后期乳腺组织正反向消减cDNA文库,筛选出24个差异基因,为进一步研究奶山羊乳腺组织基因调控机理奠定了基础。     

miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。     

奶用后备牛不同生理阶段乳腺发育特点及营养调控作用

后备牛阶段的乳腺发育决定成年后的产奶性能,而不同生理阶段的乳腺发育有其不同的特点。奶牛出生、初情期和妊娠期营养水平对乳腺生长发育和优质奶牛培育至关重要。通过日粮营养素调控乳腺发育是提高奶牛产奶性能的重要环节。本文就奶用牛后备牛阶段的乳腺发育特点及规律,乳腺发育对成年泌乳性能的影响,乳腺发育的评价指标及后备牛乳腺发育营养调控做一综述。     

猪催乳素受体基因第8内含子多态性检测及效应分析

采用PCR-SSCP技术分析了杜洛克猪、长白猪、大白猪、马身猪、山西瘦肉型猪SD-〖KG-*4〗Ⅰ系、SD-〖KG-*4〗Ⅱ系、SD-〖KG-*4〗Ⅲ系和山西白猪等8个猪种372头个体催乳素受体基因（PRLR）第8内含子多态性,检测到A、B、C 3个等位基因和AA、AB、AC和CC 4种基因型。等位基因A在所有品种中频率都较高（0.50~0.62）,等位基因B在杜洛克猪中频率较低（0.12）,在其它品种中频率为中等（0.24~0.44）,等位基因C在杜洛克猪和SD-Ⅲ系中频率较高（0.26）,在其他品种中频率很低（0~0.04）。对AA和CC 2种纯合子进行克隆测序和同源序列比较,发现在扩增片段内有4处突变,即G→A、T→C、A→G的转换突变和TTT插入突变,都发生在PRLR基因的第8内含子。利用140头母猪头胎产仔记录和118头山西白猪后备猪生长发育记录,采用最小二乘分析方法研究了PRLR基因型对猪繁殖性状和生长发育性状的影响,结果表明不同基因型母猪的头胎总产仔数和产活仔数差异不显著。但PRLR基因型对后备猪乳头数、6月龄体重和背膘厚等性状有显著影响,AA型个体的乳头数显著高于AC型（P<0.05）;AC型个体的6月龄体重和背膘厚显著高于AB型（P<0.05）。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌葡萄糖转运体和胰岛素受体表达的发育性变化

本试验旨在研究不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌葡萄糖转运载体(GLUT)1、GLUT4和胰岛素受体(IR)mRNA表达的发育规律.试验以1、7、30、60、90和150日龄蓝塘和长白两品种猪背最长肌、半膜肌和半腱肌组织样品cDNA为模板,采用实时荧光半定量PCR的方法,检测猪GLUT1和GLUT4 mRNA在不同骨骼肌中的表达模式.结果显示:1)1～ 150日龄蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌GLUT1 mRNA表达存在相似的发育变化规律,在1日龄时相对表达丰度最高.2)1 ～ 150日龄蓝塘和长白猪半膜肌和半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化,变化速度和程度存在品种差异.1日龄和150日龄时蓝塘猪背最长肌GLUT4mRNA相对表达丰度低于同日龄长白猪(P>0.05),而在其余日龄时高于同日龄长白猪(P>0.05).3)蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌IR mRNA相对表达丰度在1和30日龄时表现出较高水平,而在7、60、90和150日龄时无显著差异(P>0.05);同日龄蓝塘和长白猪之间IR mRNA相对表达丰度无显著性差异(P>0.05).结果表明:猪骨骼肌GLUT1 mRNA的表达在不同生理阶段存在差异,猪骨骼肌GLUT4 mRNA的表达在不同品种和生理阶段存在显著差异,且其与IR mRNA的表达相关性较弱,无明显规律.     

牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建及其在牛乳腺中的表达

将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶牛乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织,产后奶样经FAPA法检测表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织,并能实现相对稳定的表达。