产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的自诱导分泌表达及免疫原性分析

为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1～2 g/L、28℃诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和出血性肠炎,严重时可导致死亡。α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学角度对该毒素进行研究具有重要意义。对α毒素的分子生物学结构和致病机理进行了简要概述,并介绍了国内外对产气荚膜梭菌α毒素的检测方法和防治措施,以期为研究产气荚膜梭菌α毒素的致病机理以及预防和治疗动物气性坏疽、肠道出血症奠定基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

SDS-PAGE法检测产气荚膜梭菌毒素型研究

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法,以便有效预防控制该病的流行和发生,利用SDS-PAGE方法,对通过ELISA鉴定的20株(A型16株、C型3株和D型1株)德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株,以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定,以确定毒素的种类,进而确定菌株的毒素型。结果表明,产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3.261,2.238~3.333,1.451~3.109mg/mL,精提外毒素的质量浓度分别为0.803,0.521~0.999,0.530~0.812 mg/mL。SDS-PAGE法检测的20株德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株中A型17株、C型2株、D型1株,与ELISA检测结果的符合率为95.0%;SDS-PAGE检测的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株全部是A型,与Multiplex-PCR检测结果的符合率为100%。说明应用SDS-PAGE方法对产气荚膜梭菌的检测结果与ELISA方法的检测结果有一定的差异性,与Multi-plex-PCR方法的检测结果一致。     

无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_m2。将GETX_m2克隆至原核表达载体pET30a-(＋)后,将pET30a-GETX_m2转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rETX_m2。利用Western blot方法,检测rETX_m2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将rETX_m2用细胞维持液稀释至100及10 μg·mL^-1,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的rETX_m2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^-1 3个剂量尾静脉注射,检测rETX_m2对小鼠的毒力。随后,将rETX_m2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100 μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测rETX_m2对家兔的免疫保护效果。【结果】 在15℃和37℃条件,rETX_m2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETX_m2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,rETX_m2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETX_m2,出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在rETX_m2浓度为100 μg·mL^-1的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg^-1剂量的rETX_m2,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,rETX_m2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450-750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500-4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌rETX_m2毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素的潜在危害分析

为调查广州市冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素危害,从广州市各大型超市随机采集鸡肉样品进行产气荚膜梭菌分离、鉴定和毒素分型,同时检测分离菌株对常用抗生素的抗药性,并采用Eric-PCR对分离出梭菌进行亚型分析。结果表明,从78个样本中分离出57株产气荚膜梭菌,所有菌株均为A型,其中,cpb2(Atypical)型40株,cpb2(consensus)型1株;含net B基因菌株1株;药敏结果显示,分离出的产气荚膜梭菌大部分对氟苯尼考、氨苄西林、青霉素敏感;值得注意的是产气荚膜梭菌分离株对仅可用于人的抗生素克林霉素、头孢氨卞的耐药率分别达73.68%和31.58%。Eric-PCR结果显示,相似性为80%时,57株梭菌可分为13个亚型,提示污染来源的多样性。     

6种中药对鸡源产气荚膜梭菌的体外抑菌试验

观察了中药抗鸡源产气荚膜梭菌的药效.从初步诊断为坏死性肠炎的病鸡中分离鉴定出产气荚膜梭菌,选用6种中药水提取物对鸡源产气荚膜梭菌进行体外抑菌试验测定其最小抑菌浓度(MIC值).结果表明,在6种中药水提取物中,黄芩、黄连的抑菌效果最好,其MIC值均为3.9 mg/mL,而穿心莲和板蓝根仅在高浓度时具有抑菌作用,具体的抑菌...     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

牛肠毒素性产气荚膜梭菌的分离及鉴定

对黑龙江省3个地区牛场疫牛进行临床诊断，剖检结果为小肠出血性肠炎和心内外膜严重出血等症状，进行了细菌的分离培养、涂片镜检、生化试验和动物感染试验。结果表明：分离菌株均为革兰氏阳性粗短杆菌，严格厌氧，在血平板上具有双溶血环，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和暴酵牛乳，肠毒素检测试验阳性，厌气肉肝汤培养物0．2mL小白鼠尾静脉注射，2～10h可使其致死。试验结果表明3个分离株均为产气荚膜梭菌。     

猪C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

为了摸清引起湖北某猪场3日龄内仔猪以出血性下痢、死亡率高的疾病病因,经病料涂片镜检、培养基接种、生化试验和血清型鉴定,诊断为C型产气荚膜梭菌感染,该菌厌气肉肝汤培养物上清0.001 m L可引起小鼠全部死亡,具有较强的毒力。     

牛产气荚膜梭菌黑龙江分离株的分型鉴定

为了对三株未知型牛源产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens,Cl.perfringens)进行基因分型鉴定,将三株未知型菌株进行厌氧培养、纯化,观察培养特性,进行革兰氏染色镜检以及生化管鉴定,根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因以及产气荚膜梭菌16S r RNA保守基因分别合成5对引物,建立PCR方法。经培养特性、革兰氏染色镜检、生化特性以及16S r RNA保守基因细菌PCR鉴定均符合产气荚膜梭菌,PCR结果表明,三株产气荚膜梭菌均为A型。     

A型产气荚膜毒素培养工艺研究

兔魏氏梭菌病是A型魏氏梭菌产生的外毒素引起的一种急性、致死性传染病,A型魏氏梭菌致病因子是菌体产生的外毒素,其中主要是产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens,CPA).如果要生产优质高效的A型魏氏梭菌疫苗,就必须培养出含大量活性的α毒素菌苗.试验采用A型魏氏梭菌菌种,按照不同比例、不同代次菌种接种及培养基中加入糊精、蛋白胨、硫乙醇酸盐物质等方法,对所产生的A型产气荚膜毒素量、生物活性进行了对比,拓宽了A型产气荚膜毒素培养工艺,对临床A型魏氏梭菌菌苗的生产和检验提供了一定地技术指导.     

一株野鸭源禽流感病毒NS基因的分子克隆和测序

根据Genbank上已发表的H4N6亚型的NS基因序列,设计一对特异性引物,成功扩增出一株野鸭源禽流感病毒扎龙分离株A/mallard/ZhaLong/88(H4N6)的NS基因,并将该片段连接到PMD18-T载体上,连接产物转化至DH5α感受态细胞,对目的片段进行测序,获得了NS基因全序列,大小为887bp。该片段的核酸序列与已知的几个毒株序列进行同源性比较,同源性为78.4%～97.6%,推导的氨基酸序列同源性为80.8%～98.6%。     

仔猪大肠杆菌·C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺

[目的]研究仔猪大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺。[方法]分别试验不同的培养时间、培养温度和接种剂量对大肠杆菌纤毛表达量和C型产气荚膜梭菌产生毒素的影响。[结果]大肠杆菌在接种剂量为3%～5%,在36～37℃条件下培养7 h,可产生较高含量的纤毛抗原;当接种剂量为1%～2%,C型产气荚膜梭菌C59-2菌株在35℃条件下培养16～20 h,可产生大量致死性毒素。[结论]该研究为研制具有较好效果的仔猪红痢、黄痢预防疫苗提供了依据。     

可形成生物膜的禽源产色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性研究

从发病鸡关节腔内分离获得1株革兰氏阳性球菌,根据细菌形态、生理生化特性、动物试验,结合16S rRNA基因核苷酸序列测定、系统进化树分析及生物膜半定量检测,确定该分离菌株为可形成生物膜的的产色葡萄球菌,该菌在正常条件下不致病。药物敏感试验和耐药基因检测发现,该菌对磺胺六甲、阿奇霉素、米诺环素等8种药物敏感,对环丙沙星、头孢噻肟钠和复方新诺明中敏,而对万古霉素等13种药物低敏甚至不敏感。检测到该分离菌株包含氨基糖苷类、四环素类和磺胺类的6个耐药基因,说明这是一株多重耐药菌株,推测其耐药性与生物膜的形成有密切关系。     

江西地区鸭疫里氏杆菌微生物学特性的研究

从江西省鸭鹅中分离到 6 0株鸭疫里氏杆菌 ,采用凝集试验和琼脂扩散试验对其血清型进行了鉴定 ,结果表明江西存在 5个血清型的鸭疫里氏杆菌 (2、JX1、JX2、JX3、JX4型 ) ,2、JX1、JX2型为目前江西地区主要流行的血清型。 80 %以上分离株对青霉素、痢特灵、氨苄青霉毒和氯霉素高度敏感 ,对阿米卡星、庆大霉素和链霉素耐药。不同血清型鸭疫里氏杆菌的培养特性较为一致 ,但部分生化特性存在较大差异     

不同血清型禽大肠杆菌外膜蛋白免疫原性研究

用提纯的O_2、O_(18)、O_(46)、O_(76)禽大肠杆菌外膜蛋白对10日龄小鸡进行免疫,ELISA检测显示抗体水平显著上升;经同型菌株和异型菌株攻毒,结果O_(46)菌株外膜蛋白免疫组用同型菌株攻毒的病变率与对照组相比差异显著(P<0.05),其余组均差异不显著,但各免疫组病变率均比对照组低。说明用禽源大肠杆菌外膜蛋白免疫,无论对同型或异型菌株的攻击,都使机体受到一定的保护作用。