应用Gateway技术构建水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体

近年来,RNA干涉广泛应用于植物基因功能研究.Gateway技术是通过采用多重载体高效构建目标基因及任何DNA片段克隆和表达载体的研究平台,该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有重组位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上.这种以重组为基础的克隆体系目前已被广泛应用于分子生物学中来分析基因的功能.本文应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了水稻基因OsDAD1的RNA干涉载体,从而证明了Gateway技术的可行性.     

棉铃虫HaHR3基因的克隆及其植物RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因,该基因含有1671 bp的完整开放阅读框。序列分析表明,HaHR3与多种昆虫蜕皮调节转录因子高度同源。利用生物信息学方法对HaHR3的结构特征进行分析发现,HaHR3具有蜕皮调节转录因子超家族的典型特征,包括两个锌指结构和一个DNA结合结构域,不存在信号肽序列和N糖基化位点。选择HaHR3基因的部分片段构建了RNAi中间载体pRNAi1017-HaHR3sa,再将HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS,成功构建了由35s启动子调控的HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3。这一载体的成功构建为下一步通过植物介导的RNA干扰技术防治棉铃虫打下了坚实的基础。     

津田芜菁隐花色素CRY1 RNA干涉载体的构建

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据Gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用Gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。     

植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达

为了研究RNA干涉在抑制芥子酶基因TGG4和TGG5表达中的作用,本文在TGG4、TGG5编码序列中设计IT45 siRNA的特异靶序列,以拟南芥7SL-4基因为模板扩增启动子和终止子,连接并克隆到植物表达载体pBP5中,构建成了siRNA真核表达载体.同时利用花序浸泡法转化拟南芥.最后酶活测定的结果显示,TGG4、TGG5基因的表达受到了大部分抑制.这说明本研究构建的RNAj载体对基因表达沉默是有效的.     

水稻WRKY转录因子OsWRKY76 RNA干扰载体的构建及表达分析

为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。     

RNA干涉技术及其在作物育种研究中的应用

RNA干涉(RNAi)是通过双链RNA(dsRNA)将同源mRNA高效特异降解,从而阻断特定基因的表达。作为一种新兴的下调表达技术在作物研究中得到广泛应用。本文简要概括RNAi的原理,回顾了近年来RNAi技术在作物基因功能研究、作物品质改良、作物抗病虫方面的应用,并对其存在的问题作了初步探讨。     

RNA干涉机制的研究进展及植物学意义

RNA干涉(RNAi)是指由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,其中small RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中起关键作用。本文综述了RNAi中siRNA和microRNA分别介导的作用机制,RNAi在植物中的研究现状,主要包括转基因植物中的RNA干涉和植物病毒诱导的RNA干涉等方面的研究概况。评述了RNAi在植物学研究中的意义,主要包括功能基因的研究、转基因植物的研究及植物抗病性研究。     

RNA干涉及其在植物改良上的应用

NA干涉是一种双链RNA诱导的转录后基因沉默现象,存在于多种生物体内.由于转录后基因沉默(PTGS)和双链RNA引起的基因沉默都具有系统传递的特性,因此可以在特定部位诱导RNAi,利用RNAi的系统传递性抑制其他部位该基因的表达.本文简要介绍了RNAi的机理,RNAi表达载体的构建方法以及RNAi传递性及其作物育种上的应用,以助于在植物研究中实现RNAi.     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇.采用PCR方法从棉花中克隆了GhCAD6基因1 569 bp的基因组序列,序列分析表明GhCAD6基因由5个外显子和4个内含子组成.为了研究GhCAD6基因的功能,构建由棉纤维组织特异性启动子E6驱动的GhCAD6基因正义、反义表达载体;同时克隆了GhCAD6基因的一段417 bp高度保守的NBD区序列,构建了GhCAD6基因的RNAi干扰载体,并将上述载体转入农杆菌菌株LBA4404中.为通过转基因技术深入研究GhCAD6基因在棉纤维发育和木质素代谢途径中的作用创造条件.     

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。     

矮牵牛RCW基因的克隆及功能分析

花色是植物的重要性状,其形成受多种因素影响。为了进一步解析矮牵牛花瓣呈色的分子机制,我们以生物信息分析、基因克隆、基因表达分析、基因沉默等技术,在矮牵牛中克隆和鉴定了一个影响花瓣呈色的基因RCW。不同矮牵牛组织中进行表达分析表明,该基因在雄蕊、雌蕊、花瓣、叶片、根、茎、萼片中都表达,但是在花瓣中的表达随着花瓣发育逐渐增强;并且受到AN1、AN11、PH3等转录因子的调控。在矮牵牛品种M1×V30中进行RNAi沉默RCW基因的表达,其花瓣中的pH值与对照相比明显降低,花瓣呈现更深的紫色。对RCW编码的蛋白进行亚细胞定位发现其位于内质网、高尔基的膜系统上,表明其可能参与pH相关蛋白的转运过程。因此,RCW基因在矮牵牛花瓣细胞中的功能,主要是通过参与pH相关蛋白的转运,调控花瓣液泡中的pH环境,从而影响花瓣的呈色过程。本研究为全面揭示矮牵牛花瓣呈色的分子机制提供了重要依据,并为今后通过分子育种手段改变植物花色提供了理论基础。     

甘蓝型油菜MYB4基因RNA干扰载体构建

拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB4(AtMYB4)编码负调控转录因子,通过对苯丙烷途径中关键酶C4H(肉桂酸4-羟化酶)基因的抑制来调控重要次生代谢物质芥子酸酯的生物合成,在防御紫外线中起重要作用。同为十字花科的芸薹属(Brassica)有多种重要的油料、蔬菜和园林作物,如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)和芥菜(B.juncea)等。本研究克隆了甘蓝型油菜MYB4基因家族的RNA干扰片段BMYB4I,将其反义片段、正义片段采用NcoI+AatII和BamHI+XbaI分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成重组载体pF-GC5941M-BMYB4I(简称为pBMYB4I)。经复合PCR鉴定表明,载体构建成功,并转化根癌农杆菌获得工程菌株。为揭示芸薹属MYB4基因调控芥子酸酯等苯丙烷物质合成的分子机理以及探索抗紫外线分子育种奠定了基础。     

RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。     

苎麻雄性不育相关基因atp6和atp9 RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。