氟对大鼠睾丸支持细胞骨架蛋白mRNA的影响

试验以原代睾丸支持细胞为对象,通过胶原酶和胰酶的消化分离支持细胞,用HE染色及GATA-4免疫荧光对分离的支持细胞进行鉴定;利用q RT-PCR法检测不同浓度(0,0.1,1,10 mg/L)Na F对支持细胞骨架ARP2,ARPC3和ARPC4处理24 h后mRNA相对表达量,旨在研究氟对雄性生殖功能的影响。结果显示,ARP2在0.1 mg/L Na F组mRNA相对表达量显著降低(P0.05),在10 mg/L Na F组mRNA相对表达量极显著降低(P0.01);ARPC4在10 mg/L Na F组mRNA相对表达量显著降低(P0.05);ARPC3的mRNA表达量没有显著变化。表明氟化钠通过引起支持细胞骨架相关基因相对表达量的下降,影响睾丸支持细胞的结构与功能,进而损伤睾丸的生精功能。     

玉米赤霉烯酮对大鼠睾丸支持细胞凋亡蛋白释放的影响及NAC的保护效应

为探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)对大鼠睾丸支持细胞凋亡蛋白释放的影响及乙酰半胱氨酸(NAC)的保护效应,用20μmol/L ZEA与100μmol/L NAC单独或联合处理睾丸支持细胞24 h,用Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡率,用Western Blot法检测调控凋亡蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,ZEA染毒组的线粒体中Cyt C与AIF表达量显著下降,胞浆中Cyt C与AIF表达量显著上升。与单独染毒组相比,100μmol/L NAC与20μmol/L ZEA联合处理组睾丸支持细胞凋亡率,Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3表达量均极显著降低,Bcl-2表达量极显著增高。结果表明,caspase依赖性和caspase非依赖性的线粒体途径均参与了ZEA致睾丸支持细胞凋亡的发生,NAC对ZEA诱导的睾丸支持细胞凋亡发生起抑制作用。     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪合成相关基因转录表达的影响

【目的】诱导3T3-L1细胞分化为3T3-L1脂肪细胞,研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪合成相关基因转录表达的影响。【方法】利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0(对照组)、0.2、0.5、1 μmol/L生物素处理,分别在12 h、24 h与48 h时检测细胞上清液中PK mRNA、GLUT-4 mRNA、FAS mRNA及ACC1 mRNA相对表达量。【结果】在试验12 h时:各试验组GLUT-4、PK、ACC1 mRNA相对表达量均极显著(P＜0.01)高于对照组,1 μmol/L组与0.5 μmol/L组FAS mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组与0.2 μmol/L组;在试验24 h时:1 μmol/L组GLUT-4 mRNA与PK mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组,0.2 μmol/L组与0.5 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组;在试验48 h时:1 μmol/L组GLUT-4 mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L 组PK mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组,0.5 μmol/L组FAS mRNA相对表达量极显著(P＜0.05)高于1 μmol/L组,1 μmol/L组FAS mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于其它组。【结论】生物素的添加可以提升脂肪细胞GLUT-4、PK、FAS与ACC1 mRNA相对表达量,且当以1 μmol/L浓度作用时对GLUT-4、PK与ACC1提升效果最佳,以0.5 μmol/L浓度作用时对FAS提升效果最佳。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2、Bax、Bid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。[方法]用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·m L~(-1))对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。[结果]不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·m L~(-1)时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著增加。[结论]DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。     

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

[目的]研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a(CYP1A)活性及其mRNA和蛋白表达的影响,明确其剂量—效应及时间—效应关系,为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据.[方法]设辛硫磷低、中、高浓度组(0.0825、0.165和0.33 mg/L)和丙酮(助溶剂)对照组,采用半静态染毒法染毒鲫鱼,分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏,以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性反映CYP1A活性,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况.[结果]辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用,辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%,且差异极显著(P<0.01,下同).辛硫磷染毒后,鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势,各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系,除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外,其他染毒时间点均呈负相关.辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平,且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%.[结论]辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响,其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显.     

雌激素及其受体ERβ在氰戊菊酯所致雄性大鼠生殖毒性中的作用

为探讨雌激素及其受体ERβ在氰戊菊酯(Fen)致雄性SD大鼠生殖毒性中的作用,采用SD大鼠将其随机分为对照组(Fen 0 mg/kg)、低剂量Fen染毒组(20 mg/kg)、高剂量Fen染毒组(40 mg/kg),每组8只,染毒组以玉米油溶解配制成不同浓度的Fen溶液等体积灌胃,对照组给予等量玉米油,每日灌胃1次,连续染毒30 d后,采用常规方法检测精子数量、精子活力及畸形率,ELISA测定雄鼠血清和睾丸中雌二醇(E2)的水平,Real-time PCR和Western Bolt检测芳香化酶(CYP19A1),ERβ,Bax, Bcl-2,Caspase 3及Caspase 9的mRNA和蛋白表达水平,TUNEL法检测大鼠睾丸生殖细胞凋亡情况,HE染色法观察睾丸病理结构.结果显示:Fen染毒30 d后,与对照组相比,在40 mg/kg组精子数量、 a级精子活力及精子活动率均显著降低,精子畸形率显著增加(p0.05);血清和睾丸E2水平均显著升高(p0.05,p0.01); CYP19A1 mRNA和蛋白表达水平在20 mg/kg和40 mg/kg组显著增加(p0.05或p0.01), ERβmRNA和蛋白表达水平在40 mg/kg组均显著增加(p0.01);大鼠睾丸Bax, Caspase 3及Caspase 9的mRNA和蛋白表达水平在40 mg/kg组均显著增加(p0.01), Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平在40 mg/kg组均显著降低(p0.01); TUNEL结果显示:大鼠睾丸生殖细胞凋亡增加且在40 mg/kg组差异有统计学意义(p0.01);睾丸病理结构发现,染毒组大鼠睾丸曲细精管生精细胞数量减少或缺失,管腔内精子减少,部分曲细精管生精细胞排列紊乱.以上结果表明,Fen可能通过上调雄性SD大鼠睾丸CYP19A1的表达,增加雄鼠睾丸E2的水平,同时,上调雄鼠睾丸ERβ的表达,过度增强雌激素-ERβ信号作用,促进生精细胞的凋亡,引起精子发生异常.     

肾上腺素对猪季节性基因表达的影响

选用部分具有季节性表达的基因,探讨肾上腺素对这些基因mRNA表达量的影响。(1)将猪肾细胞(PK15)分别置于含有100,250,500,750,1 000 nmol/L肾上腺素的培养基中培养6 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ADRβ2、ARNTL、CLOCK、IL-6R、NR3C1、VDR的mRNA表达量的变化。结果表明:1 000 nmol/L肾上腺素处理PK15细胞时,与对照组相比ADRβ2、IL-6R的mRNA表达量明显升高,差异极显著(P0.01);VDR的mRNA表达量降低,差异极显著(P0.01);CLOCK、NR3C1、ARNTL的mRNA表达量无明显变化。(2)选择1 000 nmol/L的肾上腺素分别处理PK15细胞6,12,24,36,48 h。qRT-PCR检测ADRβ2的mRNA表达量变化。结果表明:与对照组相比,培养12 h时ADRβ2的mRNA表达量达到1.6倍,差异极显著(P0.01),随着培养时间延长,ADRβ2的mRNA表达量逐渐降低,36 h时降到最低,为对照组的0.4倍,差异显著(P0.05)。这说明肾上腺素对部分季节周期性变化的基因具有调节作用,季节变化产生应激时可以通过肾上腺素影响ADRβ2、IL-6R、VDR的表达,从而影响机体功能。     

ZEA与DON单一及联合染毒致仔猪睾丸支持细胞凋亡的影响

为研究玉米赤霉烯酮(ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)单一与联合染毒对仔猪睾丸支持细胞凋亡的作用机理,以10 μg·mL^-1 ZEA与0.2 μg·mL^-1 DON 对睾丸支持细胞单一与联合染毒处理24 h,采用CCK-8法检测细胞活率,电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞术、免疫荧光检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,荧光定量PCR检测凋亡相关基因表达量。结果显示,ZEA与DON单一及联合染毒均可导致仔猪睾丸支持细胞活率下降,细胞超微结构损伤,凋亡率升高,并下调线粒体相关抗凋亡基因Bcl-2表达,上调促凋亡基因Bax、Bid以及下游凋亡相关基因Caspase-3与Caspase-9的表达量,且联合作用大于单一作用。本试验结果表明,ZEA与DON可通过线粒体途径诱导仔猪睾丸支持细胞凋亡,且联合毒性大于单一毒性,表现为亚加性效应。     

玉米赤霉烯酮对原代大鼠睾丸支持细胞增殖相关基因表达以及氧化应激的影响

研究玉米赤霉烯酮(ZEA)体外对原代大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell)增殖相关基因波形蛋白(vimentin)和细胞周期蛋白D1(CCND1)表达及对氧化应激中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的影响。体外分离培养原代大鼠睾丸支持细胞,不同浓度的ZEA作用细胞20 h,采用MTT法检测细胞活力,荧光定量PCR检测Vimentin、CCND1基因mRNA的表达,Westblot检测其蛋白的表达,并且检测细胞培养液中SOD、GSH-PX活力。结果表明:与对照组相比,Vimentin、CCND1 mRNA表达量都随着ZEA浓度的升高而降低,但是Vimentin蛋白表达量却没有明显变化,CCND1蛋白表达量和mRNA表达量一致。SOD活性、GSH-PX活性均随着ZEA浓度的升高呈现增高趋势。结果表明,ZEA对体外培养大鼠支持细胞具有生殖毒性作用,影响Vimentin、CCND1的表达调控,导致细胞产生氧化应激效应从而使SOD与GSH-PX活性产生变化。     

Cu~(2+)胁迫对中华绒螯蟹毒性作用及免疫相关基因表达的影响

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为实验对象,运用毒理学方法和实时荧光定量PCR技术分析Cu~(2+)胁迫对中华绒螯蟹的毒性作用及免疫相关基因表达的影响。结果发现,试验72 h,低浓度组(0.1 mg/L和对照组)中无明显死亡现象,而高浓度组(0.5 mg/L和1.0 mg/L)中全部死亡,说明高浓度Cu~(2+)胁迫对中华绒螯蟹具有明显的毒性作用;进一步分析发现,Cu~(2+)(浓度为0.1 mg/L)胁迫对中华绒螯蟹免疫相关基因脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)、Tube、Dorsal、酚氧化酶原激活酶(PPAF)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞粘附蛋白(PXN)表达也产生显著影响,LGBP基因mRNA表达量在胁迫36 h时显著高于对照组(P0.05);PPAF基因mRNA表达量在胁迫12 h和48 h显著高于对照组(P0.05);Tube基因mRNA在胁迫48 h时显著高于对照组(P0.05),而72 h时显著低于对照组(P0.05);Dorsal基因mRNA表达量在胁迫48 h时显著高于对照组(P0.05);GPx基因mRNA表达量在胁迫36 h显著高于对照组(P0.05),而72 h时显著低于对照组(P0.05);GST基因mRNA表达量在胁迫36 h和48 h显著高于对照组(P0.05);PXN基因mRNA表达量在胁迫12 h时显著高于对照组(P0.05),而72 h时显著低于对照组(P0.05)。结果表明,重金属Cu~(2+)胁迫对中华绒螯蟹具有明显的毒性作用,且显著影响其免疫模式识别蛋白相关基因(LGBP)、免疫信号传导相关基因(Dorsal、Tube)及免疫效应相关基因(PPAF、GPx、GST、PXN)的表达。