吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的分离及体外培养

为了更好地开展对吕梁黑山羊这一特色地方品种资源的保护研究,采用组织块贴壁法,成功分离、培养并获得具备典型形态特征的吕梁黑山羊耳缘皮肤成纤维细胞。经过反复冻融试验检测细胞能够稳定传代和保存,同时对其进行了电转染条件的初步摸索。结果表明,在电压240 V,脉冲时长20 ms的条件下,转染效率较高。该细胞的分离培养为开展种质资源保存及相关繁殖生物技术研究提供了较好的平台,同时也为后续开展转基因克隆和基因编辑研究奠定了良好的基础。     

血清体积分数对培养黑山羊成纤维细胞的影响

为了建立并完善吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞培养体系,为进一步的克隆试验提供最佳生长状态的供体细胞,在常规培养液的基础上添加不同浓度的新生牛血清(0,5%,10%,20%,40%),每天在倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,并用台盼蓝染色法统计细胞数目,连续观察7 d,绘制生长曲线,比较不同血清体积分数的培养液对吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞体外培养的影响。结果表明,吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞虽然在不同血清体积分数的5组中均有生长增殖,但生长状态不同,差距较大;其中,10%的血清培养液试验组培养的细胞生长状况最好,细胞形态完整清晰,增殖快,数量多,更适合此细胞的生长。不同体积分数血清的培养液对成纤维细胞的生长具有一定影响,10%血清体积分数的培养液最适合吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的培养。结果可为进一步研究克隆、基因转染、构建基因文库等提供生物学材料。     

滩羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

【目的】以滩羊胎儿皮肤组织为材料,获得符合体细胞克隆转基因基本要求的供体细胞系。【方法】取滩羊胎儿皮肤组织,采用组织块法分离培养获得滩羊胎儿成纤维细胞,观测其形态和生长情况,鉴定其性别,并对其染色体核型和红色荧光报告基因质粒(pmCherry-N1)转染等生物学特性进行研究。【结果】采用组织块法成功获得了滩羊胎儿成纤维细胞,其细胞群体倍增时间(PDT)约为48h;5代、15代、25代滩羊胎儿成纤维细胞核型分析表明,各代细胞染色体均为2n=54,未见异常;滩羊胎儿成纤维细胞的转染效率较高,约为50%,对最终获得的稳定表达红色荧光蛋白的胎儿成纤维细胞进行核型分析,结果证明遗传物质没有发生变化。【结论】建立了滩羊胎儿成纤维细胞系,为滩羊分子育种奠定了基础。     

吕梁黑山羊种质特性研究与地方标准制定

为挖掘地方特色种质资源,指导特色畜牧业的快速发展,以吕梁黑山羊主产区的临县、柳林等选育点吕梁黑山羊为研究对象,采取形态学和行为学观察、生产性能测定等方法,对吕梁黑山羊种群体型外貌、体质量、体尺、产肉性能、绒毛性能、繁殖性能等种质特性进行了研究,并在此基础上制定出《吕梁黑山羊》地方标准。该标准的制定对吕梁黑山羊遗传资源的评价、保护、选育、开发、规范化生产都具有重要意义。     

麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养与核型分析

为获得适合于克隆麇鹿的供体细胞,本试验对麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征、核型分析和冷冻保护剂等进行了研究。通过组织块培养法获得麋鹿皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3～4次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并经过免疫荧光鉴定;麇鹿染色体数目为2n=68,核型式为2（M）＋64（A）,XY（A,M）;含10％NCS的DMEM培养基最适宜细胞生长;复苏后可获得87．78％的贴壁率。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究

目的:对大鼠皮肤成纤维细胞进行分离培养并观察形态。方法:组织块培养法分离大鼠成纤维细胞并进行传代培养并通过细胞形态学观察和HE染色对其细胞进行鉴定。结果体外培养的成纤维细胞呈梭形或多角形,24小时贴壁,通过HE染色,细胞核被染成蓝紫色,胞浆被染成粉红色。结论:该方法成功培养了大鼠背部皮肤的成纤维细胞,所获得的大鼠背部皮肤成纤维细胞可在体外稳定培养,为一些组织来源较少的成纤维细胞培养提供一种有效且可行的实验方法。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

不同种猪品种对克隆胚胎体内外发育的影响

[目的]促进体细胞克隆技术的大规模产业化应用。[方法]以长白猪、杜洛克猪2个品种种猪不同个体的耳部成纤维细胞为供体细胞,体外构建克隆胚胎,并对其克隆胚胎体内外发育以及产仔情况进行研究。[结果]长白猪、杜洛克2个品种种猪克隆胚胎分裂率、囊胚率分别为100%和83.7%、31.3%和19.1%。将来源于2个品种不同个体供体细胞的共3 419枚体外构建克隆胚胎移植给19头代孕母猪,结果发现16头代孕母猪共产下64头克隆仔猪;长白猪和杜洛克猪受孕率分别为83.3%和84.6%,平均窝产仔数分别为(1.7±2.87)和(2.0±2.3)头,平均初生重分别为(0.92±0.35)和(1.18±0.39)kg,以上指标2个品种间均差异不显著。长白猪克隆效率为0.84%,显著低于杜洛克猪(2.42%)。[结论]该研究比较了不同种猪品种克隆胚胎体内外发育以及出生情况,证明来源于成年种猪的耳部组织成纤维细胞可以有效用于克隆种猪,但克隆效率存在品种差异。     

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。     

浅谈山西吕梁黑山羊品种资源的保护与发展

吕梁黑山羊是吕梁市独特的畜禽遗传资源,通过介绍当前吕梁市黑山羊的养殖现状与生产性能,重点分析了保护濒临灭绝的吕梁黑山羊的必要性和可行性,并针对养殖中可能存在的问题,提出进一步加强领导重视、政策扶持、打造品牌、探索新路、保护品种、重视选育等措施,为黑山羊长期地健康发展提供保障。     

上海市农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎研究团队

近十年来团队在地方猪种种质资源长期保存、猪体细胞克隆等技术领域进行了深入研究。2005年在我国首先获得猪超低温胚胎冷冻后代、并建立了猪精液5mL大管冷冻技术,为地方猪种种质资源长期保存提供了有效的技术手段;2007年获得体细胞克隆巴马实验小型猪,建立优化了猪体细胞克隆技术,为异种器官移植及猪育种提供了新的研究途径。近年来先后主持、参加上海市、国家及国际合作研究项目10余项,     

拟胚体对成体细胞参与胚胎嵌合的影响

试验尝试构建成体细胞同小鼠早期胚胎的嵌合共生胚胎.取成年人皮肤组织的成纤维细胞,慢病毒转染皮肤成纤维细胞标记EGFP荧光蛋白,同小鼠早期8-细胞胚胎进行嵌合.结果显示慢病毒高效标记人皮肤成纤维细胞表达EGFP荧光蛋白,通过皮肤成纤维细胞与小鼠胚胎干细胞形成的拟胚体环境作用后,皮肤成纤维细胞成功与小鼠胚胎形成嵌合胚,嵌合囊胚形成率为38.08%,表达EGFP荧光蛋白的皮肤成纤维细胞能够嵌合到小鼠胚胎的不同部位.嵌合胚在胚胎干细胞分离培养环境下进行培养,嵌合到小鼠内细胞团的皮肤成纤维细胞参与小鼠内细胞团的组成,参与小鼠内细胞团组成的胚胎占嵌合胚比率为1.74%.小鼠胚胎干细胞拟胚体环境作用可以成功介导人皮肤成纤维细胞同小鼠早期胚胎形成嵌合共生体系.     

科研简讯

我校2项研究在2006年5月获北京市科学技术进步奖一等奖:1)“应用体细胞克隆技术生产和拯救优质种牛”以李宁教授为带头人的研究群体,围绕体细胞克隆牛的生产技术开展了全面系统的研究,建立了1套较为完整有效的体细胞克隆技术平台,包括高产奶牛、优秀种公牛和优质地方品种牛在内的不同类型的体细胞系73个;通过比较供体细胞对克隆牛生产效率的影响,建立了有效的供体细胞选择体系;对体细胞克隆生产的关键技术环节进行了优化,提高了体细胞克隆牛的生产效率,其中克隆囊胚的发育率为36·2%、移植妊娠率为36·1%、产犊率为15·8%。冷冻卵母细胞为胞…     

徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达

【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA（质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达,为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。     

哺乳动物卵母细胞去核方法的研究进展

随着"多莉"羊的诞生,体细胞克隆技术近年来发展迅速,并获得了一大批克隆动物.但克隆动物的效率仍然偏低,这与克隆技术各个环节的完善程度有关,卵母细胞的去核就是其中的重要环节之一.本文对近年来常见的几种卵母细胞去核方法作了详尽的论述,以期为该领域的科研工作者提供参考.     

太行黑山羊FGF5基因CDs区的序列特征及其表达规律研究

【目的】克隆太行黑山羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时荧光定量表达检测。【方法】于2009年的7～10月份采集太行黑山羊的皮肤组织样品,利用RT-PCR方法克隆FGF5基因CDs区序列,并分析其序列特征及在不同生长发育时期的表达情况。【结果】太行黑山羊FGF5基因CDs区全序列长度为813bp,编码270个氨基酸,其中包含一个FGF结构域(87～221位氨基酸);太行黑山羊FGF5基因CDs区核苷酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,92%,90%,90%和86%,其编码氨基酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,91%,91%,91%和91%;实时荧光定量分析结果表明,在检测的4个月份的皮肤组织中,FGF5基因在9月份表达量显著高于7、8、10月份(P0.05),而7、8、10月份之间表达量无显著差异(P0.05)。【结论】太行黑山羊的FGF5基因编码的氨基酸高度保守;太行黑山羊毛囊发育在7、8月份处于生长期,9月份由生长期向退行期过渡,10月份进入退行期。     

鸡MyoG基因在成纤维细胞中的表达

利用分子克隆技术,通过RT-PCR反映扩增、克隆、测序含有Eco RⅠ/XhoⅠ酶切位点的MyoG片段,构建真核荧光表达载体pEGFP-N1-MyoG,并通过脂质体瞬时转染鸡成纤维细胞,对表达产物进行RT-PCR和SDS-PAGE鉴定。结果表明,经脂质体介导重组体pEGFP-N1-MyoG可成功转染鸡成纤维细胞,RT-PCR和SDS-PAGE电泳证实pEGFP-N1-MyoG可在鸡成纤维细胞中表达出MyoG蛋白。该结果为进一步研究MyoG基因的生物学作用奠定了基础。     

转Fat-1基因体细胞克隆草原红牛研究

Fat-1基因的转基因动物克隆,为研究ω-3多不饱和脂肪酸的功能提供了高效、准确的医学、营养学动物模型。试验成功建立了草原红牛耳部成纤维细胞系,将Fat-1基因转染到草原红牛成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆。以转基因细胞为核供体,体外成熟牛卵母细胞为核受体构建转基因克隆囊胚,比较未转基因与转基因克隆胚胎的体外发育情况。结果表明,体细胞重构胚体外囊胚率分别为26.04%和26.04%,两者之间无显差异著(P>0.05)。转Fat-1基因的草原红牛重构桑葚胚或早期胚胎移植到延边黄牛子宫内,有7头妊娠,但没能够获得妊娠足月个体。