牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】同期发情处理后,经B超声波连续监测(每12h一次)采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF);其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞(granulosa cells, GCs),抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高(99.4%),与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF(P0.01),且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因–苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT–PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK–8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明：ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个...     

牛ODF2和PDF2转录组测序筛选卵泡发育的相关基因

为研究牛卵泡发育过程中影响卵泡发育的重要调控基因及其表达模式,通过B超声波监测并采集牛卵泡发育波中出现偏差期后的第二大卵泡(ODF2)和偏差期前的第二大卵泡(PDF2),建立卵泡颗粒细胞RNA文库并进行高通量测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG通路分析,再经Gene Cards功能查询筛选牛卵泡发育的相关基因.结果表明:转录组测序共获得35 325个基因,其中,高表达基因15 536个,进一步筛选出504个差异表达基因;GO分析表明,504个差异表达基因中参与生物过程的基因占39.49%,细胞组分占46.96%,分子功能占13.55%;KEGG通路分析表明,共有97个差异表达基因通过10条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Gene Cards进行功能查询后,共筛选出18个与牛卵泡发育密切相关的调控基因.在卵泡发育过程中,PYCARD、MYC、PRICKLE1、TGFBR3、PIK3R3、SOX4、TOPORS、KREMEN1、STK11和NTRK1可能直接参与细胞增殖或凋亡.     

牛卵泡CMKLR1基因CDS区克隆及结构分析

[目的]旨在确定牛卵泡趋化因子样受体1(Chemokine-like receptor 1,CMKLR1)全CDS区序列结构并对其分子特征和三级结构进行预测。[方法]采集正常发育牛卵泡分离颗粒细胞(Granulosa cells,GCs),提取总RNA后反转录,特异性引物扩增、测序,获得全CDS区后生物信息学方法进行结构分析和功能预测。[结果]CMKLR1CDS区全长1 089bp,编码362个氨基酸;蛋白质一级结构中分别包含4个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和50个磷酸化位点;三级结构和功能域分析表明,CMKLR1有7个横跨胞膜的平行的α螺旋结构,属于典型的G蛋白偶联受体。[结论]多糖基化、磷酸化位点的存在以及蛋白定位的特殊性,提示该蛋白功能较为复杂。该研究为后期深入探讨CMKLR1与牛卵泡发育的关系奠定了基础。     

槟榔江水牛FSHR基因分离鉴定及其功能初步分析

【目的】揭示槟榔江水牛FSHR基因的结构与功能。【方法】采用RT-PCR法克隆了槟榔江水牛FSHR基因的编码区全序列,并利用生物信息学方法对其基因编码产物的理化特性、结构及功能进行了初步分析。【结果】槟榔江水牛FSHR基因编码区全长为2 088 bp,编码695个氨基酸。氨基酸序列比对显示:槟榔江水牛FSHR与其他哺乳动物的同源性在89.4%以上。槟榔江水牛FSHR蛋白N-端含信号肽和7个跨膜结构,属细胞膜疏水蛋白。该蛋白含有7tmA_FSH-R、LRRNT、LRR重复单元和GnHR_trans等4个保守结构域。槟榔江水牛FSHR二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲所构成,分别占41.73%和38.71%。FSHR最有可能在细胞的转运和结合过程中发挥功能作用(概率0.827)。【结论】槟榔江水牛FSHR属于G蛋白偶联受体家族,在细胞质中合成后转运到达细胞膜,推测通过与FSH激素结合后激活G蛋白偶联作用,进而促进其精子和卵泡的发育与成熟。     

不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。     

基于Illumina平台转录组测序筛选牛卵泡发育调控基因

运用超声波监测技术,采集母牛发情期出现偏差前的第一大卵泡PDF1和出现偏差后的第二大卵泡ODF2,分别分离卵泡颗粒细胞(GCs),构建RNA文库,用Illumina2000测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG pathway分析,经Genecards功能查询,筛选牛卵泡发育相关基因。结果表明:数据库搜索共获得35 325个基因,其中有意义的表达基因15 645个,从中筛选获得差异表达基因608个;GO分析表明,608个差异表达基因中参与生物过程的基因占60.46%,细胞组分的基因占20.08%,分子功能的基因占11.46%;KEGG pathway分析表明,608个差异表达基因通过9条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Genecards功能筛选,共获得11个与牛卵泡发育密切相关的调控基因——SESN3、COL3A1、CCNE1、CAV1、CACNA1H、ITPR1、PIK3R3、MYC、PTGFR、CDK6、GAPDH,它们直接参与细胞增殖分化及信号通路调节。     

小麦YABBY基因的生物信息学分析

[目的]对小麦YABBY基因家族成员TaYAB1与TaCRC基因进行生物信息学分析。[方法]利用相应的计算机软件及数据库,对这2个基因的理化性质、结构与功能进行分析预测,同时构建其同源基因的系统进化树。[结果]TaYAB1与TaCRC蛋白为不稳定亲水性蛋白,其蛋白结构中无跨膜区,属于非分泌性蛋白。TaYAB1与TaCRC蛋白亚细胞定位于细胞核,有多种二级结构形式。功能分析预测这2个蛋白具有转录与转录调控功能。[结论]在小麦背腹极性建立中,小麦TaYAB1与TaCRC基因可能在转录调控过程中发挥重要作用。