EuCAD基因不同位置片段RNAi对烟草木质素合成的调控效果

为尾叶桉GLU4无性系肉桂酰乙醇脱氢酶基因(EuCAD)调控其木质素的合成提供技术参考,以模式植物烟草为试验材料,采用生物信息学技术分析其EuCAD基因序列,根据保守结构域的分布情况选择EuCAD基因不同位置的4个片段(S1、S2、S3和S4)分别构建RNA干扰载体并转化烟草后获得转基因烟草植株(pS1、pS2、pS3和pS4),检测分析转基因烟草植株中CAD基因表达水平、茎部解剖结构、木质素及纤维素的含量变化。结果表明：S1和S2片段对木质素的调控效果最明显,其转基因烟草植株pS1和pS2的基因表达水平分别较野生型降低87.48%和87.30%,木质素含量较野生型降低15.26%和11.44%;S3和S4片段的调控效果较差,pS3和pS4多项表型检测结果与野生型相比降幅较小或无差异。     

正义、反义、干涉调控肉桂酰辅酶A脱氢酶基因对烟草的影响

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是在木质素合成途径中起到关键作用的酶,负责催化肉桂酰辅酶A类物质的还原反应生成相应的醛类化合物.分离得到毛白杨CCR基因的cDNA.将CCR基因以正义、反义和干涉的形式,通过农杆菌介导的方法转入烟草中,Southem杂交以确定转基因成功.在获得的转基因植株中,所有下调基因的植株都表现出可溶性酚酸含量下降,木质素含量也有明显的下降趋势,纤维素含量则有上升,可能是对木质素含量下降的一种代偿性增长.植物细胞壁组分的含量变化表明CCR基因可能是一个控制木质素代谢途径的一个很好的调控点.     

抑制CCoAOMT表达对烟草木质素生物合成的影响

 通过农杆菌介导法将毛白杨CCoAOMTcDNA反向导入烟草。PCR、PCR Southern和Northern点杂交检测表明 ,CCoAOMTcDNA已反向整合到烟草基因组中并在转录水平表达。将转基因株系移栽温室 3个月后 ,以Klason法测下部茎木质素含量。与对照相比 ,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度的下降 ,其中下降最多达 37%,表明抑制植物内源CCoAOMT的表达可有效地降低木质素含量。     

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

反义CCoAOMT基因转化烟草调控木质素生物合成

通过农杆菌介导法将美洲黑杨CCoAOMT cDNA反向导入烟草,获得一批转基因抗性植株.经PCR检测,证明CCoAOMT基因已成功反义转入到烟草植株中.通过对转基因植株和对照植株木质素含量的对比分析,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度下降,下降最多的达9.2%.     

棉花NBS-LRR类基因RNA干扰载体的构建及烟草转化

【目的】初步获知棉花NBS-LRR类基因的生物学意义,构建干扰载体。【方法】以抗枯萎病棉花中棉12号为材料,用霍格兰营养液培养至三叶期,进行枯萎病菌接菌诱导处理,以不接菌为对照。利用cDNA-AFLP技术筛选差异基因片段,在GenBank中进行序列同源性比对,找到抗枯萎病基因片段,该基因片段的序列与GenBank中报道的序列同源性达到72%。将此基因片段以正向和反向插入到pPZP35S,经限制性酶切和质粒PCR鉴定。【结果】已成功构建了干扰载体。采用农杆菌侵染法将干扰载体转入烟草中。【结论】为研究棉花NBS-LRR类基因的功能打下基础,为通过转基因技术深入研究该基因在棉花抗病机理创造条件。     

花生油酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

根据克隆的花生油酸脱氢酶基因序列,选取高度保守的260 bp片段,插入植物双元表达栽体pFGC1008中,构建完成具有反向重复序列的pFGC/2nd表达栽体,利用RNAi以抑制内源目的基因表达,为获得高油酸亚油酸比值的花生种质奠定基础.     

ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响

烟草类胡萝卜素对烟叶品质和可用性有重要作用,ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)是调控类胡萝卜素合成积累的关键酶之一。为研究ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响,从贵州省烟草科学研究院福泉试验基地取样品,采用不同株系相同部位的方式取样,与贵烟1号(GY1)对照,筛选出能够构建RNA干扰(RNAi)载体并成功转化的转基因植株,建立ZDS基因的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR的检测方法,检测新鲜烟叶中ZDS基因表达水平并分析其遗传表型的变化。结果表明,ZDS和其他类胡萝卜素合成关键酶基因的表达均下调,其遗传后代出现异于正常植株的白化与矮化的表型。证明了ZDS基因对产生这种异同发挥了作用,也充分佐证了RNAi技术在基因功能分析中有着重要的作用,但这些样品表现出白化和矮化的表型是否是由于烟草类胡萝卜素的合成受到抑制尚不确定,还需要进一步验证。     

RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究进展

基因工程技术近年来在作物研究领域发展迅速,RNA干扰（RNAi）作为一项重要的基因沉默技术,具有高效性且特异性强的显著特点,现已广泛应用于后基因组时代,对研究作物基因功能,抗性和品质改良等有着重要作用。中国烟草研究已进入基因组时代,随着烟草基因组测序的开展,RNAi作为一门反向遗传学技术在烟草中的应用越来越多。本文介绍了RNAi 技术的作用机制和特点,重点介绍了RNAi在烟草基因功能研究、抗病研究、抗虫研究及烟草品质改良研究中的应用,并对RNAi 技术在烟草中的应用前景进行了展望。     

siRNA干涉禽流感病毒PA基因在鸡胚成纤维细胞中的表达

用阳离子脂体质转染试剂将人工合成的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)转染鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明,针对禽流感病毒(AIV)H5N1亚型核蛋白(NP)基因的siRNA能在AIV感染后1,2,3 h显著抑制NP基因的表达,表达水平分别降低3,1.4和2.5倍.     

南方根结线虫乳酸脱氢酶基因克隆及其沉默效应分析

【目的】对南方根结线虫乳酸脱氢酶基因（mildh）进行克隆分析,并探索mildh沉默对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）病害的抑制作用。【方法】在前期研究中,利用生物信息学方法在线虫全基因组中预测了一些线虫RNA干扰（RNAi）表型基因。本研究以预测的线虫ldh设计特异引物克隆南方根结线虫中mildh。对克隆到的mildh序列进行了特征分析后,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术,将其导入番茄植株,并接种南方根结线虫,研究mildh基因沉默对根结线虫根结数量影响。【结果】克隆到的mildh包含1个完整的编码框序列,编码315个氨基酸。该基因与预测到的mildh核苷酸序列一致性高达94.9%,所编码的氨基酸一致性高达95.5%。构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的沉默载体pTV-mildhi,并用该沉默载体对番茄植株进行处理后,接种南方根结线虫。60 d后统计发现,pTV-mildhi处理的番茄植株上根结数分别比空载体对照减少48.6%,比清水对照降低48.4%。【结论】mildh基因沉默对南方根结线虫具有显著的抑制作用,也说明mildh可能参与根结线虫的致病性,该研究对线虫的病理学研究及线虫病害防控研究提供了新的理论基础。     

白腐菌对烟叶木质素含量的影响

为了降低烟叶木质素的含量,达到降低卷烟烟气杂气,提升卷烟吸食品质,进行了白腐菌生物法降低烟叶木质素含量的研究.结果表明:白腐菌处理烟叶的最佳条件为pH为物料自然值,菌种添加量为3％,温度为35C,此条件下可降低木质素含量30％左右,烟叶整体品质显著提升.     

Effect of RNA Interference Hsp72 Gene Expression on Development of Mouse Preimplantation Embryos

The method of RNAi was used to inhibit the expression of induced heat shock protein 70 （Hsp72） in the 4-cell stage mouse embryos and the embryo development competence was analyzed to identify the functions of Hsp72 on embryonic heat resistance. The results indicated that the inhibition rates of siRNA1 for Hsp72 mRNA and Hsp72 protein were 87.1 and 78.5%, respectively. The blastocysts development rates were 41, 86, and 84% for the siRNA1 group, the LipofectamineTM 2 000 exposed group, and the 37℃ group, respectively, and the hatched blastocysts development rates for the above three groups were 35, 72, and 68%, respectively. The data suggest that the siRNAI has a significant inhibiting effect on Hsp72 gene, and Hsp72 gene silence reduces the blastocysts development rate and hatched blastocysts rate after heat shock during the development of mouse preimplantation embryos.     

番茄生长素应答因子ARF1基因RNA干涉载体的构建及其对番茄的转化

将番茄生长素应答因子家族成员之一ARF1中的500bp左右的特异片段导入到植物载体pBI121中,构建成RNAi表达载体(pBI121-ARF1),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养和抗性筛选获得再生植株.PCR检测再生植株,初步鉴定为阳性植株,为后续进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

RNAi的研究进展(英文)

RNAi是由与靶基因同源的内源或外源双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)所引发的一种在动植物中普遍存在的基因沉默现象。它最早在植物体中被发现,现在已发展成为一种生物技术,并成为了后基因时代的重要研究手段。对RNAi技术在生物基础、医学、药学、植物学等领域的研究成果进行了综述。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。