柑橘CsERF1基因RNAi载体的构建及转化

用RT-PCR克降柑橘的CsERF1基因cDNA序列,并连接到TA克隆载体pMD-19T上;经限制性内切酶2次双酶切,CsERF1基因的正、反向片段被分别插入到双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了Cs ERF1基因的RNA干涉载体;通过农杆...     

果蔗Rar1基因反义载体的构建及遗传转化初步研究

摘要：本研究根据其它作物已克隆的RAR1基因的两个氨基酸保守位点设计简并引物,用果蔗cDNA进行PCR扩增,得到果蔗Rar1基因片段序列,推测出的氨基酸序列与其它作物推测出的氨基酸序列的CCCH结构域和一个锌结合域CHORD-Ⅱ具有很高的相似性,初步证明了所克隆的果蔗Rar1基因片段具有正确的序列信息。并构建了果蔗Rar1反义植物表达载体pCAM-RAR1,转化农杆菌后侵染果蔗的愈伤组织并得到初步验证,为转基因植物的获得以及果蔗Rar1基因功能鉴定奠定了基础。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

水稻TWH基因RNAi载体的构建及遗传转化

根据RNAi表达载体的设计原则,以TWH基因为靶基因,将长度253 bp目的片段通过正反两个方向插入表达载体pR1301中,构建RNAi表达载体pR1301-TWH.通过根癌农杆菌EHA 105介导法将其导入水稻品种武育粳3号,获得34株阳性转基因植株,为进一步深入研究TWH基因功能奠定了基础.     

马铃薯 StMKK1基因RNAi干扰载体的构建及遗传转化

丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联反应在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用。为了获得转基因马铃薯,进一步探索 StMKK1在信号转导和胁迫响应中的功能,从四倍体栽培品种马铃薯Desiree 的cDNA中克隆到 StMKK1基因302 bp的目的片段,并将目的基因的正向片段利用EcoRⅠ和KpnⅠ,反向片段利用HindⅢ和XbaⅠ与重组载体35s-pART27进行连接,构建成35s- StMKK1-pART27-RNAi表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法,将35s- StMKK1- pART27-RNAi载体导入马铃薯品种Desiree中,得到7株沉默的阳性马铃薯转基因植株,不同的转基因植株中 StMKK1基因的沉默效率经检测均在92%以上。     

乙烯应答因子W17基因RNAi表达载体的构建及小麦遗传转化

干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质.ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子.本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi.采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株.半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制.本研究为深入分析小麦ERF基因的功能与作用机制,进而通过分子育种进行小麦抗性改良奠定了基础.     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

RinPKS1基因过表达载体的构建及遗传转化树莓

RinPKS 1基因编码的蛋白是具有催化合成柚皮素查尔酮和苯亚甲基丙酮的能力双功能酶,即具有CHS和BAS活性。BAS又是树莓酮生物合成途径中的关键酶。【目的】为了验证RinPKS 1在树莓酮生物合成途径中是否发挥作用。【方法】将RinPKS1基因与pCambia 1304连接,构建成植物过表达载体PCA-RinPKS 1,通过根癌农杆菌介导,将RinPKS1遗传转化入树莓中,以提高树莓中树莓酮的含量。利用q-PCR分别检测转PCA-RinPKS1和阴性对照(空载体)的树莓材料中RinPKS 1基因的表达量。【结果】转RinPKS1基因树莓材料中RinPKS1的表达量比转阴性对照(空载体)有很大提高,分别是根高出15.8倍;茎高出3.17倍;叶高出4.39倍。【结论】RinPKS 1在树莓中得到转录水平过表达。     

马铃薯StCYP83B1基因过表达载体构建及遗传转化

旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1 mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系确认该蛋白的表达;利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法,将p35S::StCYP83B1 mCherry转入马铃薯中,随机挑选3株转基因植株进行鉴定：PCR检测证明StCYP83B1已整合到马铃薯基因组中,反转录实时定量PCR检测表明StCYP83B1在转化植株中的转录水平比未转化的对照植株上调40~49倍,免疫印迹检测表明StCYP83B1蛋白可以在转化植株中正常表达。同时,对转化马铃薯植株及微型薯的表型鉴定表明,StCYP83B1过量表达并不影响马铃薯的正常生长发育。该稳定转化马铃薯植株的获得为后续深入解析StCYP83B1基因的免疫功能及作用机制奠定了重要材料基础。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。     

番茄SlMYB12 RNAi表达载体构建及功能的初步研究

以Micro-Tom番茄(Solanum lycopersicum L)为材料,构建SlMYB12 RNAi载体,利用农杆菌介导法导入番茄;对转基因植株评价发现,SlMYB12基因被干扰后植株出现了植株矮化、果实变小、种子数减少和转色期提前等变化;实时荧光定量PCR检测表明干扰植株果实中类黄酮路径相关基因SlCHS、SlF3H、SlF3’H表达量下降,SlCHI基因表达量上升。     

陆地棉“洞A”转录因子GhbZIP1的克隆及表达分析

结合RACE技术与hi-TAIL PCR技术克隆得到1个新的棉花bZIP转录因子的cDNA序列,暂命名为GhbZIP1。该基因包含1个完整的包含471bp的开放阅读框,编码156个氨基酸。GhbZIP1蛋白具有典型的bZIP保守结构域,与拟南芥等植物bZIP1蛋白的保守区相似性较高,推测棉花GhbZIP1与拟南芥AtbZIP1功能类似。此外,qPCR分析表明GhbZIP1基因在洞A可育株花药的4个主要时期(小孢子单核早期、小孢子单核期、双核期及花粉形成期)的表达均明显高于不育株。由此提示,GhbZIP1基因可能与棉花雄性不育相关。     

拟南芥CYCD3;1基因植物表达载体的构建 及在烟草中的遗传转化分析

为了分析植物D型细胞周期蛋白在细胞周期中的作用,采用PCR方法从拟南芥花序中克隆出At CYCD3;1基因的全长c DNA序列。该基因的开放读码框为1131 bp,预测编码376个氨基酸,蛋白质的分子量为42701.6 Da,蛋白质的等电点为4.89。构建植物表达载体p ROKII-At CYCD3;1,并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中。通过PCR及q RT-PCR检测显示,At CYCD3;1成功插入烟草基因组并在转录水平表达。表型观察显示转基因株系与野生型株系相比主要表现为花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,茎干弯曲,叶片卷曲,根尖细胞变小。综上,拟南芥At CYCD3;1基因的过量表达影响了植物的生长发育。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

南瓜蚜传黄化病毒P0蛋白基因ihpRNA载体构建及烟草转化

P0蛋白是南瓜蚜传黄化病毒基因组编码的基因沉默抑制子。根据已克隆的CABYV P0蛋白基因序列,设计带酶切位点的特异性引物,PCR扩增用于构建RNAi表达载体的P0蛋白基因正反义片段。将正反义片段分别插入到含有内含子的中间载体pBSint上,得到重组的中间载体pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I双酶切pBSint-P0-F-R,将切下的包括内含子和正反义P0蛋白基因在内的片段定向克隆到植物表达载体pCambia1300上,得到含有发卡结构的RNAi表达载体pCambia-P0-F-R。通过农杆菌介导的方法将该表达载体转化本生烟,经PCR检测,得到4株阳性转基因植株。为设计出更广谱、特异有效的抗病毒策略及研究病毒蛋白的功能特性及其侵染机制提供实验材料。     

陆地棉蛋白质二硫键异构酶基因(GhPDIL5-2a)的克隆及其在花药中的表达分析

利用电子克隆的方法设计特异引物,克隆陆地棉的1个二硫键异构酶(Protein disulphide isomerase like)基因的全长序列。序列分析表明:该基因没有内含子,开放阅读框的长度为1 293bp,编码的多肽序列含有430个氨基酸。该基因与红麻HcPDIL5-2a基因具有97%的相似性,将该基因命名为棉花GhPDIL5-2a。取单核期花药进行半定量RT-PCR分析发现:GhPDIL5-2a在陆地棉洞A不育株和可育株花药中表达无差异,在供试的其他不同品种中的表达也无差异。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析

为研究转录因子GhWRKY41在陆地棉盐胁迫应答过程中的作用,基于差减文库分析结果,利用RT-PCR和RACE技术,克隆了GhWRKY41基因(GenBank登录号为HM002635)。该基因cDNA长度为1 630bp,含有ORF(Open reading frame)为1 068bp,编码355个氨基酸的多肽,包含2个内含子。通过瞬时表达分析亚细胞定位,结果表明,转录因子GhWRKY41定位于细胞核,符合转录因子特性。转基因株系发芽试验结果表明,过量表达GhWRKY41基因,可显著提高转基因棉花在干旱、盐和低温胁迫下的发芽率;利用Real-time PCR技术,证明在盐和干旱胁迫条件下,转基因株系中GhWRKY41基因的表达量显著上升。GhWRKY41基因在根、茎和叶片中表达存在差异,根系中胁迫6h上调达到最高,茎中则胁迫48h达到最高,而叶片中仅6和24h上调表达。进一步比较转基因棉花与野生型棉花的纤维品质性状,结果表明GhWRKY41的过表达可以提高转基因棉花的衣分。因此,GhWRKY41参与了棉花响应盐和干旱胁迫应答过程,且过表达可提高转基因棉花耐盐性和耐旱性。