牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性单克隆抗体(MAb),用含有BVDV E2基因的真核表达质粒pcDNA-E2免疫4周龄～6周龄BALB/c鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以BVDV作为抗原建立间接ELISA筛选及4次连续克隆获得3株能稳定分泌抗E2MAb的杂交瘤细胞系,分别命名为2E2、3D12、4D6。MAb亚类鉴定表明,2E2和4D6为IgM类,3D12为IgG2a亚类,轻链均为κ链。经western blot和间接免疫荧光检测证明3株MAb针对E2的构象表位,并且3D12株MAb能与BVDV及猪瘟病毒(CSFV)结合,2E2和4D6MAb只能与BVDV结合。     

牛病毒性腹泻病毒p80蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞(MDBK),提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体p ET30a,得到重组表达质粒p ET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,挑选单菌落并扩大培养,经IPTG诱导和SDS-PAGE以及Western-blot分析表明重组蛋白p80获得了表达,分子质量约为44 ku。同时用浓缩的BVDV培养液免疫6~8周龄的Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白p80作为检测抗原的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光(IFA)和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效价的测定。结果表明:重组p80蛋白具有很好的反应性;获得8株稳定分泌针对BVDV p80蛋白的杂交瘤细胞株,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11;8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水,采用BVDV作为包被原的间接ELISA方法测得其效价为1×105~1×107;8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性;8株单克隆抗体的抗体亚类均为IgM/κ。说明制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株：3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定，3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类，3C11株为IgG2a亚类；杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A8、3C7、3E9、3C11与BCV、BRV均无交叉反应，但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应，而3C11与HCV、BDV无交叉反应，3C11显示出较好的特异性；杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1：1000和1：200000，该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒S2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1，轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价，结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800，腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示，感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带；IFA结果显示，感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明，制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应，反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力，结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重...     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),采用纯化的H5N6 AIV免疫BALB/c鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法进行筛选,获得2株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3D9和2B10。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞培养上清液抗体效价分别为1∶1×10~3和1∶1×10~4,腹水的抗体效价分别达到1∶1×10~5和1∶1×10~6; 3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链; Western blot分析表明,2株杂交瘤细胞上清均能与不同的AIV感染的尿囊液在56 kD处发生特异性反应,并能与原核表达的重组NP蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验显示,2株单克隆抗体均能与不同的AIV感染的MDCK细胞产生特异性反应。以上结果表明,本研究针对H5N6 AIV的NP蛋白制备了2株单克隆抗体,且都具有较好的特异性、保守性和广谱性,为今后禽流感诊断方法的开发奠定了基础。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性.     

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒杂交瘤细胞构建及单克隆抗体制备

TGEV-PL株在PK15细胞上增殖,经浓缩纯化获得TGEV抗原,建立了间接ELISA检测方法.应用杂交瘤技术获得3株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞.经检测其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤细胞染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,腹水抗体效价达1∶6×104,与6株毒(菌)株的抗原之间无交叉反应.经阻断试验证实,其分泌的McAb能识别抗原是TGEV所特有的抗原决定基.     

猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的PPV重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4株为Ig M类,1株为IgG类,Western blot检测表明,5株单抗均识别猪细小病毒VP2蛋白;间接免疫荧光鉴定表明,5株单抗均与PPV全病毒发生反应;间接ELISA鉴定与其他相关病毒的交叉反应性表明,制备的5株单抗不与TEGV、PRV和PEDV反应,表明所制备的抗体与猪细小病毒具有较强的特异性反应。