蓝细菌血畿飞逝基因的克隆及其向甘蓝型油菜中的转化

血红蛋白存在于动物、植物、细菌、真菌、酵母、藻类、原生动物等生物体中。利用PCR方法克隆了蓝细菌Synechocystis sp. PCC 680的血红蛋白基因SLR2097,该基因属于“truncated”血红蛋白家族,大小为375 bp,编码123个氨基酸残基。数据库搜索的结果显示所有的血红蛋白都有一个保守基序,即‘F-[L]-x(4)-[G]-G-[T]-x(2)-[Y]-x-[G]-[R]-x-[M]-x(3)-H’, “truncated”血红蛋白家族也有该结构,表明它们的进化祖先相同。将获得的SLR2097连接到双元载体pCAMBIA1300-CaMV35S上,并转化甘蓝型油菜品种宁油12。转基因油菜表型分析表明,血红蛋白基因SLR2097在油菜中的表达促进油菜的生长并缩短发育期,引起早熟,这些表型对改良油菜的农艺性状有重要的应用价值。     

用in planta方法转化甘蓝型油菜

用in planta方法进行遗传转化极大地促进了模式植物拟南芥的功能基因组研究,但在农作物中仍少有in planta的成功报道。我们采用in planta方法,用含有质粒pSG529、pHTT613和ApSCO的农杆菌菌株转化中油821、湘油13、宁RS-1、S2501-1、华双3号等甘蓝型油菜品种。在适宜的条件下,将根癌农杆菌菌液浸染甘蓝型油菜花序10 d至15 d     

农杆菌介导反义油酸脱饱和酶基因转化甘蓝型油菜

以甘蓝型油菜花油3号的子叶柄作为转化受体,利用农杆菌介导法,将反义油酸脱饱和酶基因导入甘蓝型油菜,获得了卡那霉素抗性植株。对再生植株进行PCR-Southern blotting检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。本文还进一步分析了影响遗传转化的一些因素。结果表明：对子叶柄进行适当的预培养,可以提高转化效率。延迟筛选也有利于提高转化效率。将处于对数生长期的农杆菌菌液稀释10倍后,外植体浸泡5-7min的转化效果最佳。     

甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因BnPAP17＿A05的克隆及遗传转化

磷是植物生长发育的必需元素之一,紫色酸性磷酸酶能够参与植物体内有机磷的降解,在油菜抗低磷胁迫中具有潜在的应用价值。本研究从甘蓝型油菜中克隆获得编码紫色酸性磷酸酶的基因BnPAP17＿A05,生物信息学分析发现该基因具有3个外显子和两个内含子,编码含有337个氨基酸的蛋白质,且该蛋白质在第7～29个氨基酸的位置有一个跨膜结构域。本研究构建了过表达载体2X35S::BnPAP17＿A05,并成功完成在甘蓝型油菜中的遗传转化,获得了11个转基因阳性株系,为深入研究BnPAP17＿A05在油菜抗低磷胁迫中的作用提供材料,也为油菜抗低磷胁迫的分子育种提供一定理论基础和实践意义。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnaM154过表达载体的构建与转化

编码含MATH结构域(Meprin and TRAF homology domain)的基因目前在油菜中研究较少。本研究以甘蓝型油菜‘湘油15’(XY15)种子发育35 d抑制差减(suppression subtractive hybridization, SSH)文库为基础,进一步筛选获得实际编码中有两个连续MATH结构域的功能未知基因,该基因全长DNA序列为1 800 bp,我们将其命名为BnaM154。将目的片段克隆后插入表达载体pFGC5941-Nap中,成功构建了pFGC5941-Nap::BnaM154过表达载体。利用农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,成功获得8株稳定遗传的转基因苗,为进一步研究BnaM154基因在甘蓝型油菜中的功能提供了科学依据。     

甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立

利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR与Δ6脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G。利用在Murashige和Skoog培养基(含有200 mmol L^–1乙酰丁香酮)培养5~7 d的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69 h (pCNR),再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下,平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS分析和PCR分析结果表明,外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern杂交表明,这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸,γ-亚麻酸含量达8.2%。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

甘蓝型油菜BnMAPK2基因的克隆及功能分析

从甘蓝型油菜中分离克隆了BnMAPK2(BnaA01g21880D)基因,cDNA及其编码序列长度分别为1516bp、1113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析表明, BnMAPK2蛋白分子量为42,497.0 kD,等电点为6.36,蛋白不稳定系数38.74,为疏水性蛋白,具有MAPKs蛋白特有的STKc_TEY_MAPK_plant(cd07858)保守结构域;蛋白二级结构中α螺旋所占比例最大,为44.05%,无信号肽;与拟南芥C族AtMAPK2的亲缘关系更近。核心元件预测结果显示,BnMAPK2-P含有响应水杨酸激素、热胁迫和光照等相关顺式作用元件,包括TCA-element、HSE、AAAC-motif和MYB结合位点等。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, BnMAPK2在甘蓝型油菜中的各个组织器官中均有表达,受到茉莉酸甲酯、水杨酸、H₂O₂、损伤、高温和核盘菌的诱导。转基因异源表达BnMAPK2拟南芥株系的表型数据发现,与野生型相比,超量表达BnMAP...     

iMyAP基因过表达载体转化甘蓝型油菜

本研究以甘蓝型油菜湘油15号叶片cDNA为模版,克隆油菜黑芥子酶协助蛋白iMyAP基因全长CDS,目的片段序列和GenBank上报道的甘蓝型油菜序列iMyAP12-Y10156同源性达到100%。将得到的iMyAP基因片段与pMD19-T载体连接,命名为T-1152。用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切T-1152和pHB载体,回收片段经T4DNA连接酶连接得到iMyAP基因过表达载体pHB-1152。通过农杆菌介导将pHB-1152转化至甘蓝型油菜湘油15号,PCR鉴定显示成功获得2株转基因植株。本实验为进一步研究iMyAP基因的功能奠定了良好的基础。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

甘蓝型油菜LPAT4基因的克隆与表达

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid actyltransferase, LPAT)是三酰甘油生物合成过程中的一个关键酶, 在脂质的合成、种子的发育以及生物膜的流动性等方面有重要作用。本研究采用同源克隆的方法, 获得LPAT4基因的2条全长CDS序列, 长度分别为1143 bp和1140 bp。生物信息学分析表明, 它们均具有LPLAT_LCLAT1样结构域, 同属于LPLAT超基因家族, 并分别被命名为BnLPAT4-1和BnLPAT4-2。时空表达分析表明, 它们均为组成型表达基因, 其中BnPAT4-1在叶中的表达量最高, 而BnPAT4-2在胚中的表达量最高。逆境分析表明, BnLPAT4-1和BnLPAT4-2在NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现出不同的表达模式。极差分析显示, ABA对BnLPAT4-1的表达影响较大, 而BnLPAT4-2的表达却对PEG4000更敏感。为进一步研究油菜BnLPAT4基因功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnTT3基因的表达与eQTL定位分析

类黄酮途径中,TT3编码的4-二氢黄铜醇还原酶是参与原花色素和花青素合成的关键酶。为了明确该基因可能的上游调控网络,利用黄籽母本GH06和黑籽父本ZY821构建的遗传图谱,以Bn TT3基因在高世代重组自交系群体中随机选取的94个株系花后40 d种子的表达量作为性状,采用复合区间作图法进行e QTL分析。结果共检测到5个表达量相关的e QTL,分别位于A03、A08、A09和C01染色体,单个e QTL解释表型变异的5.22%~24.05%。A09染色体上存在2个主效e QTL,单个e QTL分别解释24.05%和16.55%的表型变异,分别位于标记KS10260~KBr B019I24.15和B055B21-5~KS30880之间,微效e QTL分布于A03、A08和C01染色体上。A09染色体上的2个主效e QTL区间(包含200 kb侧翼序列)与拟南芥、白菜、甘蓝和芸薹族近缘物种基因组同源区段具有很好的共线性关系。基因注释结果表明检测到的e QTL均为trans-QTL,2个主效e QTL区段共包含78个基因,包括MYB51、MYB52和b ZIP5转录因子,可能为Bn TT3基因的上游直接调控因子,对这些基因功能的深入分析将有助于阐明甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子调控机制,为黄籽候选基因的克隆筛选奠定基础。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

油菜油体钙蛋白基因BnClol的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术.从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白(caleosin)的基因BnClol.其全长1 058 bp的BnClol mRNA(GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3'末端Poly(A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子.Northern杂交结果表明,油菜中BnClol在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达.半定量PCR结果显示,BnClol在油菜种子吸水膨胀后前2d的茎中明显表达.证明在油菜种子发育期间,BnClol对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的.具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关.推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基(GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1～16位氨基酸残基组成的a-螺旋和17-61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80-120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域.N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca2 的EF-手结构.中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结(proline-knot)模体,在92～114位氨基酸残基组成的a-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用.     

甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因BnECR的克隆及功能分析

反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2, 3-enoyl-CoA reductase, ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥等的ECR基因设计引物,采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR的全长cDNA序列和对应的基因组序列,命名为BnECR (GenBank登录号分别为FJ899705和FJ899706)。序列分析结果显示,BnECR的全长cDNA序列为1 328 bp,对应的基因组序列为2 093 bp,由4个外显子组成,在ORF的上、下游分别有一个163 bp的5′UTR和一个232 bp的3′UTR。根据编码区预测BnECR前体蛋白为一个310个氨基酸残基的多肽链,包含ECR蛋白的重要功能位点K₁₄₄、R₁₄₅及一个NAD(P)H结合基序G₂₂₅SGGYQIPR/HG₂₃₄。NCBI Blastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明, 该基因与拟南芥AtECR基因的同源性最高,是对应拟南芥AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明,BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达,其中在茎中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子,表明BnECR可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。将BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中,分别转化野生型酵母By4743和突变体菌株YDL015c,添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明,BnECR在酿酒酵母中有效表达,转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%,比对照增加了52%;对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。     

播娘蒿蛋白酶抑制剂基因DsTI2转化油菜的研究

通过播娘蒿角果的cDNA文库克隆测序,得到1个蛋白酶抑制剂基因序列,命名为DsTI2.该基因编码一个含有100个氨基酸残基肽链,含有保守活性位点环"CAPRIFPSFC".利用农杆菌介导,将DsTI2导入甘蓝型油菜品系NJ5424中.PCR和RT-PCR检测证明外源基因已导入到油菜基因组中,且能正常表达.酶活性分析表明,转基因油菜叶片蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性明显高于对照.初步抗虫实验表明,喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫生长缓慢、死亡率升高.