牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定

GnRH（gonadotropin-releasing hormone）是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子，在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用。GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起（median eminence）末端，然后进入下丘脑垂体门脉循环（hypothalamo hypophyseal portal circulation）（四足动物）或直接通过轴突末梢（大多数硬骨鱼）把信号传递给刺激性腺的细胞，与特异性受体结合，刺激促性腺激素（GtHs，gonadotropins）的合成与释放，参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能。伴随着GnRH的研究，研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣，牙鲆（Paralichthys olivaceus）是中国重要的海水养殖鱼类，本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的Type Ⅰ GnRH受体，并对其组织特异性表达作了分析，为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础。 在本研究中，以海水养殖牙鲆为材料，从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5′-和3′-RACE技术克隆得到了1671bp牙鲆促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）全长cDNA序列，包括147bp的5′-UTR、1248bp的开放阅读框和276bp的3′-UTR，GenBank登录号是DQ011872。牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示，其存在许多保守的特征，牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域：1个N端胞外结构域（1～44个氨基酸残基）、1个大的跨膜结构域（45～324个氨基酸残基）和1个C端细胞质区域（325～415个氨基酸残基）。空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋（45—64、76—95、114—135、156—176、207—224、267—286、305—324），这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的。 氨基酸序列系统进化分析表明，牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性（85％同源性）。已知的硬骨鱼GnRH—R基因的系统进化分析表明，存在两种类型的GnRH-R基因：Type Ⅰ GnRH—R和Tpye Ⅱ GnRH-R基因。在牙鲆GnRH—R的氨基酸序列中，具有Type Ⅰ GnRH—R共有的典型基序：CAFVT（TMⅢ）和DlLEGKVSHSLTH（TMⅦ开始的序列处），表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH—R。 GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops，这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上。牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSA／（DRXXXI／V）基序，这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活；另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中（DPVIY），这个基序参与到一些GPCRs（包括GnRH-R）的内在化（internalization），同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用。在第三个胞内loop中，鱼类GnRH—R有个保守的Ala残基（在牙鲆中为Ala^250），其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用。 在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中，在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥，是受体的正确折叠必需的。和其他的GnRH-R一样，牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys（Cys^112和Cys^190）可以形成的潜在的二硫桥。这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH—R对GnRH肽的选择性。 GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守，但含有糖基化位点，是GnRH—Rs表达、GnRH—Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的。将mouse的GnRH—R糖基化位点引进到人GnRH-R中，可以增加受体的数量，但不影响受体结合力或肽选择性。牙鲆Type Ⅰ GnRH—R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点（N^11SSW、N^15GSS和N^22WTA），此外，在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点（N^100ITV和N^178VTI），牙鲆Type Ⅰ GnRH—R含有的糖基化位点比哺乳动物要多，牙鲆糖基化位点的数目是否／怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力，应该进一步研究。 在牙鲆GnRH-R的第一个胞内Ioop中，存在1个和tGnRH-R Ⅲ基序（^80KRKSH^84）一致的基序（^69KRKSH^74），这个基序是Gs识别基序（BBXXB，B代表碱性氨基酸，X代表任何一种氨基酸）。已经证明这个基序和cAMP产生相关，cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性。 和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似，牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴。这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的，在第三个胞内loop中，牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点（^233SKR^235和^262TLK^264）；在C端尾巴中，存在1个PKC磷酸化位点（^402TAR^404）。牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3（SH3）结合区域（PxxP序列）（^340PPAP），能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录，二者都集中于MAPK水平。 RT—PCR分析表明，GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达，暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为；RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达，其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达，GnRH肽在卵巢中具有自分泌／旁分泌功能，对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用。[中国水产科学，2006，13（4）：536—546]     

褐牙鲆♀×大西洋牙鲆♂杂交育种研究

为探讨褐牙鲆和大西洋牙鲆杂交育种的可行性,通过繁殖调控使褐牙鲆和大西洋牙鲆同步性成熟,采取正反交试验,获得了褐牙鲆(♀)×大西洋牙鲆(♂)杂交F1代——花美牙鲆(Paralichthys olivaceus♀×P.dentatus♂)。花美牙鲆受精卵卵径平均1.01mm;孵化适宜温度15～21℃,盐度25～35,孵化率平均71.3%,初孵仔鱼全长2.5～2.7mm;仔鱼在16～20℃下36d后伏底变态,变态个体全长平均11mm,育成率32.5%;反交受精率和孵化率极低,未获得杂交后代。简述了其发育时序和形态特征,探讨温度、盐度对花美牙鲆胚胎和仔鱼发育的影响,比较亲本与杂交鱼早期生长特征,初步分析反交不成功的原因。     

大西洋牙鲆Paralichthys dentatus(Linnaeus)工厂化养殖技术的研究

大西洋牙鲆是西北部大西洋所产的一种经济鱼类,于2003年引进我国试养。本文较详细概述大西洋牙鲆工厂化养殖技术的方法,取得了较好效果。     

大西洋牙鲆育苗技术初探

目前在我国还没有大规模养殖大西洋牙鲆,苗种供应主要是依靠进口。为探索大西洋牙鲆的繁育技术,作者通过生产性育苗,对亲鱼的饲养、挑选及促熟,卵的孵化及鱼苗培育的有关技术措施进行探讨。     

大西洋牙鲆雄鱼与漠斑牙鲆雌鱼杂交的初步研究

从山东引进全长3-5cm的美国大西洋牙鲆和漠斑牙鲆幼鱼到宁德市飞鸾镇海鑫育苗场,经2年6个月养殖后,从养殖群体中挑选出大西洋牙鲆雄鱼为父本,漠斑牙鲆雌鱼2为母本,在生殖季节通过埋植激素和人工调控环境条件催熟亲鱼,采用人工受精方法,获得杂交受精卵478．6g,受精率为62．9％,孵化率为75．3％,获得初孵仔鱼36万尾。经过65d的培育,育出平均全长4．20cm的杂交鱼苗22万尾,育苗成活率61．1％。鱼苗生长迅速,初步表现出杂交子代的优势性状。     

大西洋牙鲆人工养殖技术

大西洋牙鲆(Atlantic flounder)，学名犬齿牙鲆(Paralichthys dentatus)或狼齿牙鲆，英文称之为Summer flounder，即夏季牙鲆或夏令鲆，也称巨齿牙鲆(Large-tooth flounder)。其肉质细嫩鲜美，营养丰富，易于烹饪。我们于2002年9月12日从美国首次引入进行养殖，本文结合国外资料和我们的养殖经验，做一概述。     

大西洋牙鲆繁殖生物学及繁育技术研究进展

总结研究了国外有关大西洋牙鲆繁殖生物学方面的研究成果,结合作者对鲆鲽鱼类的研究,从大西洋牙鲆繁殖习性、性腺发育指数、繁殖力、卵仔鱼发育和变态等几个方面综述了大西洋牙鲆的繁殖生物学特性。提出了亲鱼选择、促熟培育、受精孵化和鱼苗培养的有关技术措施。     

虾池养殖大西洋牙鲆技术探讨

大西洋牙鲆是分布于北美洲大西洋沿岸的一种底层鱼类,是一种极具发展潜力的养殖新品种。它对环境的适应能力比较强,能适应不同的养殖条件。利用对虾养殖池养殖大西洋牙鲆有非常广阔的前景。将对虾养殖池经过清淤、消毒进水,于5月下旬前后投放10cm左右的大西洋牙鲆鱼苗,经过投饵、水质管理等措施;到11月下旬前后出池,出最大个体达756g,平均437g。     

大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)仔、稚、幼鱼形态观察

文中对大西洋牙鲆仔、稚、幼鱼各期发育时间及特征进行观察记录,并对各发育阶段进行显微摄像。大西洋牙鲆室内人工育苗水温18℃～22℃,盐度30,pH8.2,光控500Lx左右。饵料为强化的轮虫、卤虫无节幼体和配合饲料。初孵仔鱼肠道细而直,孵化后3d～4d肛门开通并开口摄食,6d～7d卵黄囊吸收完毕,仔鱼前期阶段结束。仔鱼后期阶段,消化道弯曲,冠状幼鳍完全形成,右眼开始上升。稚鱼期右眼完全迁移至左侧,变态完成,营底栖生活。幼鱼期基本具有成鱼的外部形态和习性。     

促肾上腺皮质激素释放激素在鱼类应激反应中的作用

下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴是机体在应激过程中被激活的重要神经内分泌系统。下丘脑的促肾上腺激素释放激素(CRH)在HPA轴的功能调节中具有重要地位。在应激反应中,促肾上腺激素释放激素是关键调节因子,协调应激过程中内分泌、自主神经、免疫和行为反应。本文介绍了近年来有关促肾上腺皮质激素释放激素的研究进展及其在鱼类应激反应中的作用,为进一步探讨鱼类应激反应的发生机制提供参考资料。     

大西洋牙鲆人工育苗常见问题探讨

大西洋牙鲆是分布于北美洲大西洋沿岸的底层鱼类,是极具发展潜力的养殖新品种。目前我国已经引进并进行人工育苗;但在人工育苗过程中存在着一些问题,如亲鱼培养和催产,受精卵孵化,饵料投喂,伏底过程,疾病防治等,在生产中要注意及时采取措施。     

牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因.经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸.5'侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3'侧翼区含有加尾信号.通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支.RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控.     

北方沿海地区大西洋牙鲆养殖模式的探讨

大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus),又名犬齿牙鲆和夏鲆。它的英文名为“Summer flounder”,其音译名为“三富鱼”,因为它的营养和口感可与“多宝鱼”(大菱鲆)相媲美,深受美国市场的喜爱,所以在中国市场上的商品名叫做“美宝鱼”。该鱼对水温的适应范围为5～31℃,10-29℃均能生长,最适生长温度为24-26℃：     

牙鲆变态中甲状腺激素调控的靶基因

本研究旨在采用新的方法找出甲状腺激素受体（TRs）介导的甲状腺激素（TH）调控的靶基因。以牙鲆（）为实验样本,表达并纯化了牙鲆p3×Flag-TRαA和p3×Flag-TRβ融合蛋白,采用一种目的基因循环扩增与筛选的方法,寻找TH直接调控的靶基因,最终筛选得到TRαA的候选靶基因11个,TRβ的候选靶基因12个,其中TRαA和TRβ存在4个相同的候选靶基因：）和MYC相关因子X（）。利用荧光定量PCR技术检验了这4个基因在牙鲆不同组织、不同变态发育期以及外源性甲状腺激素和硫脲处理后各个变态发育时期的表达情况,发现在TH含量升高时,靶基因表达量降低;TH含量降低时,靶基因的表达量上升,从而验证靶基因受到TH的负向调控,证实TH在促进牙鲆变态中也存在抑制靶基因转录的情况。本研究旨为研究TH调控牙鲆变态的发育网络提供基础资料。     

大西洋牙鲆冷冻精子×褐牙鲆卵杂交胚胎的发育及胚后发育

利用大西洋牙鲆冷冻精子与褐牙鲆卵授精,培育出了生长健康的杂交鱼苗。并对杂交后代的胚胎发育、胚后发育和不同温度下的生长特征进行了研究。利用OLIMPUS显微镜连续观察和描述了冷冻精子受精杂交胚胎的发育,在水温15～17.1 ℃,其受精卵经过卵裂、囊胚、原肠胚、胚孔封闭、肌节胚、尾芽胚、心跳胚、出膜胚等时期的发育,经历65 h 57 min完成胚胎发育进入胚后发育,发现胚胎搐动15 min后心脏开始跳动。利用OLIMPUS解剖镜每天观察和记录一次鱼苗的生长形态,并测定其体全长;将杂交鱼苗的胚后发育划分为卵黄囊吸收期（出膜后1～6 d）、变态前期（出膜后7～25 d）、变态期（出膜后25～30 d）和变态后生长期（出膜30 d以后）4个时期。对16～17 ℃、18～19 ℃、20 ℃和22～23 ℃4个温度环境下胚胎发育的研究结果显示,杂交胚胎宜于在16～20 ℃的水温下发育,鱼苗在22～24 ℃孵化出膜后2～3 d大量死亡。对18～19 ℃、20 ℃、22 ℃、和24 ℃ 4个温度下稚鱼的生长研究结果显示,变态期稚鱼在22～24 ℃水温下饲养时变态和生长速度较18～19 ℃快。     

美国大西洋牙鲆南方海上网箱养成技术探讨

针对牙鲆养殖在我国南方养殖普遍存在不能渡夏的现象,本文分析了美国大西洋牙鲆在南方海上网箱养殖的可行性,并根据实践总结出:重视海区选择、精致网箱结构、苗种运输与适度放养、加强日常管理等方面的养殖技术和养殖模式。     

促黄体素释放激素和多巴胺拮抗物对鲇促性腺激素释放的作用

以珠江流域鲇为研究对象，分别在性腺发育早期、性腺发育晚期、性腺发育成熟与产卵前期、性腺退化期注射促黄体素释放激素类似物和多巴胺D2受体拮抗物，处理后6h、12h、24h测定血液中的促性腺激素水平变化。结果表明，在性腺发育的各个时期，促黄体素释放激素类似物和多巴胺D2受体拮抗物联合注射能显著剂激鲇促性腺激素分泌；鲇脑垂体促性腺激素的分泌受下丘脑释放的促性腺素释放激素和多巴胺的双重调节，多巴胺只能抑制促性腺素释放激素诱导的促性腺激素分泌。在建立鲇人工繁殖技术时，可采用促黄体素释放激素类似物和多巴胺D2受体拮抗物联合注射方法。     

海区网箱养殖大西洋牙鲆试验

大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)又称犬齿牙鲆、夏鲆,主要分布于加拿大新斯科舍和美国佛罗里达沿海之间。属广温广盐性鱼类。2002年,山东青岛三高公司首次从美国引进试养,我站2004年5月从该公司引进鱼苗500尾在连江大官坂海区试养获得初步成功。2005年4月中旬又引进鱼苗4120     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)家系生长性状遗传效应分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)优良养殖新品种培育是防止其品种退化和提高经济效益的主要途径,数量性状遗传评估是牙鲆育种的主要方法之一.本研究利用已建立的牙鲆核心群体建立42个牙鲆家系,分别测量140、170、200、380日龄各家系生长相关性状(体重、全长和体宽),通过MINQUE、REML和BLUP方法对其进行数量遗传分析.结果显示,不同时期生长性状的变异系数为10.56％-38.62％,其中,体重的变异系数最大,全长和体宽的变异系数都较小,不同性状的变异系数均随着日龄的增加而减小.3个性状的加性方差分量比率为(0.13±0.01)-(0.29±0.06),随机方差分量比率为(0.71±0.06)-(0.87±0.01),狭义遗传力为(0.13±0.01)-(0.29±0.06),广义遗传力为(0.15±0.01)-(0.54±0.06),以上遗传参数均达极显著性水平(P＜0.01).综合比较3个性状在不同时期的遗传效应,结果发现,F0990、F1005、KS和F0719这4个群体亲本都为极显著正向效应,F0751、F0768、F0780、F09121、F0927和RS这6个群体亲本都为极显著负向效应(P＜0.01),其余的亲本均为一般效应.表型相关系数在0.82-0.96之间,遗传相关系数在0.72-0.97之间.利用BLUP方法对380日龄测量的数据进行育种值估算,结果发现,亲鱼体重育种值为14.63-100.05,其中,体重育种值最高的亲鱼个体为F1005-8、F09119-11、F09125-4、F0915-57、F09104-12、F1264、F0908-38、F0927-20、F1005-53、F0990-6、F09125-7、F0751-14和F1005-42.家系平均体重育种值为20.87-35.60,其中,平均体重育种值最高的家系为F1416、F1428、F1442、F1418、F1427、F1408、F1402、F1412和F1446.以体重育种值为依据选留的家系育种值与根据表型值选留的家系育种值比较可得:体重育种值选择比其表型值的选择效率高81.91％,育种值选育更好.本研究为牙鲆优良家系的建立及新品种的培育筛选出了性状优良的亲本和家系,同时为牙鲆育种计划的制定提供了重要理论依据.     

复方中草药对彭泽鲫促生长作用的研究

用0 5%、1 0%和1 5%3种质量分数的复方中草药添加于彭泽鲫的基础日粮中,以研究其促生长效能及其最佳添加量。结果表明:复方中草药以1 0%、1 5%配比能显著增强彭泽鲫的生长性能(P<0 05),试验组和对照组的相对增重率分别为106 39%、117 41%、113 73%和98 54%,饲料系数比对照组分别提高了5 29%、13 66%和12 33%。本复方中草药的最佳添加量为1 0%。