大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响

采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。     

大鼠表皮干细胞分离培养的方法研究

目的是探讨大鼠表皮干细胞的分离培养的方法。方法主要以0~7日龄SD大鼠为材料,采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分离表皮细胞,IV型胶原黏附法对分离的表皮干细胞进行培养,观察其形态、生长情况。结果是培养后的表皮干细胞胞质近中央处有圆形核并开始形成小克隆,细胞即连接成片,紧密相靠,相互衔接,呈铺路石状。结论为该方法分离培养的表皮干细胞纯合,呈现典型的上皮型细胞形态,可用于皮肤的再生修复。     

大鼠心肌细胞体外培养特性研究

对采用组织块法分离培养的大鼠心肌细胞进行了鉴定及相关的生物学特性研究,以进一步用于心脏细胞工程、组织工程的种子细胞及其他方面的研究。结果显示,分离培养出的心肌细胞呈多种形态,整体形如铺路石样,生长中的心肌细胞常伸出伪足,形状为星形,培养至第4天的心肌细胞常可相互交织形成细胞簇,出现节律性的搏动;心肌细胞的PAS糖原染色呈阳性,胞浆内大量的糖原颗粒被染成品红色;细胞凋亡-Hoechst检测试剂盒荧光染色显示,心肌细胞核内荧光物质分布均匀一致,没有出现细胞凋亡时所特有的荧光致密浓染或碎块状致密浓染现象;对第1代和第6代心肌细胞生长曲线测定显示,心肌细胞生长曲线呈"S"型,2代心肌细胞生长曲线趋于一致;心肌细胞α-sarcomaricactin(α-SA)免疫组化鉴定显示,心肌细胞呈强阳性且具有较高纯度。上述结果表明,利用该方法培养的心肌细胞具有较高的增殖能力和纯度,可作为种子细胞用于心脏的细胞工程和组织工程及其他方面的研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良

本研究的目的是改进经典的Seglen原位两步胶原酶灌流法,建立稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法.采用胰酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养,过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定.结果显示,本法培养的肝细胞产量高、活力好,每只大鼠可获得约2×108个肝细胞;相差显微镜观察不同生长期的肝细胞,细胞贴壁后变平变薄,双核细胞呈岛状连接的形态学特性;PAS鉴定,肝细胞内由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色.表明改良的方法稳定、高效,为进一步的试验研究奠定了基础.     

大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法

体外分离培养肝细胞是人工肝、毒理学、药理学、生理学以及基因工程等研究的基础,良好的分离技术是获取高活性肝细胞的前提.     

运动对大鼠心肌细胞与一氧化氮合酶的影响

【目的】研究运动对大鼠心肌细胞及一氧化氮合酶的影响,探讨运动引起心肌细胞凋亡的可能机制。【方法】通过游泳训练建立大鼠有氧训练组和力竭过度训练组模型,以常规饲养大鼠为对照,检测各组大鼠心脏质量与心系数(心脏质量/体质量)的变化,采用Western blot检测心肌细胞中p53蛋白的表达,DNA ladder法检测心肌组织细胞的凋亡,并测定各组大鼠心肌与血清中的NO含量及结构型NOS(cNOS)、诱导型NOS(iNOS)活性。【结果】力竭过度训练组大鼠心脏质量和心系数增加,心肌细胞中p53蛋白的表达显著增加,与过度训练时大鼠心肌细胞凋亡基因的调控有关。DNA ladder检测结果显示,有氧训练组大鼠心肌与血清中的cNOS活性升高,有少量的NO生成,对大鼠心血管系统产生了良性影响,使大鼠心血管系统功能增强;而力竭过度训练组出现了明显的凋亡条带,长期的过度负荷使大鼠心肌与血清中的iNOS活性升高,产生的较多NO对细胞具有毒性作用。【结论】不适宜的运动负荷会促使大鼠心肌细胞凋亡,NO可能参与了心肌的损害过程。     

乳鼠心肌细胞的体外三维培养

【目的】探讨应用PLGA泡沫支架材料,在体外建造组织工程化心肌组织的可行性。【方法】采用顺序消化及差速贴壁法分离纯化乳鼠心肌细胞,将分离所得的心肌细胞接种于PLGA多孔支架材料上,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和二维培养的心肌细胞进行比较。【结果】复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与二维培养的细胞相比,细胞代谢更加旺盛。【结论】采用组织工程技术有可能在体外培育出组织工程化心肌组织。     

大鼠睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。     

大鼠原代肝细胞培养方法的建立

体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多,但均存在一些缺陷。对胶原酶灌流法进行改良,采用细胞密度为6×105个/mL,细胞生长状态好,既能保证细胞活率,又能满足下一步试验要求。用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注,胰酶最适浓度为0.18%,且灌流时维持最适温度37℃,分离得到的肝细胞存活率大于90%,且纯度很高,是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。     

Discrete microdomains with high concentration of cAMP in stimulated rat neonatal cardiac myocytes

The second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is the most important modulator of sympathetic control over cardiac contractility. In cardiac myocytes and many other cell types, however, cAMP transduces the signal generated upon stimulation of various receptors and activates different cellular functions, raising the issue of how specificity can be achieved. In the general field of signal transduction, the view is emerging that specificity is guaranteed by tight localization of signaling events. Here, we show that in neonatal rat cardiac myocytes, beta-adrenergic stimulation generates multiple microdomains with increased concentration of cAMP in correspondence with the region of the transverse tubule/junctional sarcoplasmic reticulum membrane. The restricted pools of cAMP show a range of action as small as approximately 1 micrometer, and free diffusion of the second messenger is limited by the activity of phosphodiesterases. Furthermore, we demonstrate that such gradients of cAMP specifically activate a subset of protein kinase A molecules anchored in proximity to the T tubule.     

机械牵张对大鼠心室肌连接蛋白43及神经钙粘附素表达的影响

目的通过观察机械牵张后大鼠左心室肌连接蛋白43(Cx43)及神经钙粘附素(N-cadherine)的改变来研究机械牵张对大鼠心室肌Cx43及N-cadherine表达的影响。方法采用膨胀球囊持续牵张Langendorff方法灌流的离体大鼠左心室心脏模型,从左心室游离壁心肌提取总核糖核酸(RNA),用逆转录-聚合酶链氏反应(RT-PCR)方法检测心室肌Cx43及N-cadherine的信使RNA(mRNA)。结果经过50 min持续牵张的大鼠左心室游离壁心肌Cx43 mRNA水平(2.105±0.480)及N-cadherine mRNA水平(1.650±0.233)较对照组(0.905±0.132,0.891±0.082)明显增高(P<0.01)。结论机械牵张使心肌细胞间连接相关蛋白表达增加,从而提高电流在相邻心肌细胞间的传导速度,可能导致心律失常的形成。     

双孢蘑菇栽培基质中线虫分离方法评价

【目的】研究双孢蘑菇栽培基质中线虫的分离方法,为双孢蘑菇线虫病调查、分离与研究提供理论基础和技术支撑。【方法】利用贝曼漏斗法分离双孢蘑菇栽培基质中线虫,对不同栽培基质类型中线虫分离速率,评价不同生产方式和培养料处理方法对线虫发生的影响。【结果】不同基质材料中线虫分离速率差异显著,在分离24 h时线虫分离速率由大到小的材料依次为棉秆、麦草、棉籽壳和土壤材料,分离速率分别为86.05%、70.91%、37.98%和28.03%;孔隙度由大到小的材料依次为麦草、棉秆、棉籽壳和土壤材料,其孔隙度依次为3.36、2.48、2.02和1.24 mL/g;线虫浓度差异显著,工厂化生产方式和二次发酵处理条件下,基质材料中线虫浓度最低,出菇前后,培养料中线虫浓度分别为0和59.21条/100g,覆土材料中分别为12和79条/100g;农法生产方式和一次发酵处理条件下,线虫浓度最高,出菇前后,培养料中培养料中线虫浓度分别为1 556.33和5 371.33条/100g,覆土材料中分别为79和5 236.67条/100g。【结论】不同基质材料类型中线虫分离速率差异十分显著,活体线虫分离速率与材料孔隙度呈显著正相关;线虫发生数量与生产方式和培养料处理方法密切相关,生产方式越先进、培养料发酵处理越彻底,线虫数量越低。     

烟草疫霉分离及生长培养基的选择

采用不同的基本培养基添加抗生素组合对烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)进行分离培养.结果表明,以V8培养基(100 mL/L Vs汁+0.02 g/L CaCO3+2 g/L洋菜)为基本培养基附加10 mg/mL氨苄青霉素+5 mg/mL制霉素+5 mg/mL多菌灵的选择培养基分离烟草疫霉的效果较好,分离成功率达100％,菌丝的生长状态也较好.菌丝分离后在V8基本培养基中培养,菌丝紧密、浓白、粗壮,菌落大、长势旺.     

新生牛睾丸细胞的分离纯化与冷冻保存

以新生牛作为实验动物,取睾丸进行制样组织学观察,并将睾丸消化成单细胞悬液,对生精上皮细胞进行分离纯化、细胞鉴定及冷冻保存,研究不同分离纯化及冷冻保存方法对睾丸细胞的影响。结果表明,新生牛曲细精管中含有精原干细胞和支持细胞,差速贴壁法能有效分离两种细胞;精原干细胞鉴定,AKP、C-kit、OCT-4均呈阳性;支持细胞鉴定,油红O、波形蛋白均呈阳性。精原干细胞冷冻保存以10%的二甲基亚砜为冷冻剂的效果最好,支持细胞冷冻保存以10%乙二醇和0.1 mmol.L-1海藻糖组合效果最好。     

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

为进一步简化、优化SD大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法,采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞,并用HE染色、油红染色、Feulgen染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。结果表明：平均0．10g睾丸组织可获得2．5×10^6个支持细胞,细胞存活率90％以上,体外培养5h后开始贴壁,96h后细胞生长速率下降,其对数生长期为3—7d,整个体外生长周期约为10～15d。对获得的纯化细胞进行鉴定,发现其形态结构及超微结构与支持细胞的形态特征一致。可见,采用三酶两步消化法和差异贴壁法,可达到分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞的目的。     

大鼠胰岛的分离、纯化与评价方法改良

【目的】简化胰岛的分离纯化方法,建立完善的胰岛评价体系。【方法】采用Ⅴ型胶原酶分离出Spra-gue-Dawley大鼠胰岛,并采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法纯化胰岛。纯化的胰岛通过双硫腙(Dithi-zone,DTZ)染色进行计数及纯度检测,丫啶橙(AO)-碘化丙啶(PI)双染色法确定分离细胞的存活率,体外葡萄糖刺激释放胰岛素试验检测胰岛的分泌活性。采用Adobe Photoshop程序改进了常规的胰岛计数方法,并进行胰岛标准计数。【结果】平均每只成年Sprague Dawley大鼠的胰腺,可获得(3 840±24)当量数(IEQ)纯化胰岛,纯度可达到90%,细胞平均存活率达92%。【结论】采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法及基于Adobe Photoshop程序的标准计数方法,可分别用于大鼠胰岛分离纯化和计数。