广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1(ApoA1)基因并进行生物信息学分析,为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据,同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础.[方法]以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板,运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列,以实时荧光定量PCR(qPCR)检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况,并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.[结果]广西巴马小型猪ApoA1基因编码区(CDS)序列长795 bp,与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%,仅第630处有1个碱基发生同义突变.ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达,且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低.广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成,其分子式为C1343H2136N376O409S5,蛋白分子量为30254.31 Da,理论等电点(pI)为5.47,属于亲水性蛋白,存在跨膜结构,不存在信号肽,有18处磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点有10处,苏氨酸磷酸化位点有6处,络氨酸磷酸化位点有2处).广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中,α-螺旋占79.92%,β-折叠占2.65%,无规则卷曲占11.12%,延伸链占6.31%,属于全α类蛋白.广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高,达99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出,广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近.[结论]广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强,以在肝脏中的表达量最高,是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子,通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型.     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

广西巴马小型猪PPARγ基因克隆及组织表达差异分析

[目的]克隆广西巴马小型猪过氧化物酶增殖物激活受体γ基因(PPARγ),并确定其在不同组织中的表达情况,为后续研究该基因在猪支原体肺炎(MPS)中的作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR克隆广西巴马小型猪PPARγ基因,并进行BLAST比对分析及其推导蛋白的生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪心脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉和脂肪中的表达情况.[结果]广西巴马小型猪PPARγ基因开放阅读框序列1515 bp,编码504个氨基酸.广西巴马小型猪PPARγ基因推导氨基酸序列与GenBank已发表的猪PPARγ基因(FJ436399.1)推导氨基酸序列同源性最高,达100.0%;而与牛(NM_181024.2)、人类(NM_005037.5)、猕猴(NM_001032860.1)、鼠(NM_001308354.1)和鸿雁(KJ019822.1)的同源性分别为92.9%、91.8%、91.5%、90.5%和83.5%,表明PPARγ基因高度保守.PPARγ蛋白分子量为57380.91 Da,理论等电点(pI)为6.88,不稳定系数49.26,脂肪指数为88.21,亲水性平均水平为-0.293,为亲水性蛋白,其二级结构主要是α-螺旋,占总数的39.09%.PPARγ基因在广西巴马小型猪大肠组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),而在肾脏、心脏和肌肉组织中的表达量极低.[结论]PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪的各组织中均有表达,但不同组织中的表达水平存在明显差异,可能与其在不同组织中的功能差异有关.     

广西巴马小型猪miR-148b慢病毒制备及靶基因通路预测分析

[目的]构建广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示miR-148b的作用机制打下基础.[方法]以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增miR-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上,构建获得pLV-miR-148b慢病毒表达载体;以pLV-miR-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相关通路.[结果]广西巴马小型猪miR-148b片段大小为385 bp,与miRBase 21.0网站上已发布猪miR-148b成熟序列(前体和侧翼序列)的同源性达100%.构建获得的pLV-miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组(P<0.01).数据库预测分析得到18个广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,分别为CLOCK(时间昼夜调控因子)、MIER1(转录调控因子)、MECP2(甲基化CpG结合蛋白)、ZNF704(锌指蛋白)、SPTY2D1(SPT2染色质蛋白)、QKI(RNA结合蛋白)、ZBTB20(锌指蛋白)、MGAT4A(钠/磷酸转运蛋白)、UHMK1(编码蛋白激酶)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶2α肽)、C6orf62(6号染色体开放阅读框62抗体)、HECW2(E3泛素蛋白连接酶)、MAP1B(微管相关蛋白)、NHS(NHS肌动蛋白调节因子)、B4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶)、ATP2A2(肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶)、AP4E1(蛋白复合物接头分子)和BBX(锌指蛋白);且发现有11条靶基因相关通路,其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路.[结论]广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,miR-148b存在18个靶基因和11条相关通路,且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用.     

广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA克隆及序列分析

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3%、50.9%和49.9%.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

广西巴马小型猪PAQR3基因克隆及表达谱分析

[目的]克隆广西巴马小型猪孕激素和脂联素分子受体3(PAQR3)基因,并研究该基因在广西巴马小型猪不同组织中的表达特性,为揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增广西巴马小型猪PAQR3基因,应用在线预测软件对其功能和结构进行生物信息学分析,并以qRT-PCR分析PA QR3基因在不同组织中的表达特性及高脂高糖诱导后的表达水平.[结果]广西巴马小型猪PAQR基因编码区(CDS)序列全长936bp,编码3l2个氨基酸,与人类(XM 0067141062)、猕猴(NM 001257693.1)、牛(XM 010806259.1)、家犬(XM 014109889.1)、家鼠(XM 006534874.2)、羊(XM_012180242.1)、鸡(XM_001233720.3) PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上,其中与猕猴的亲缘关系最近,与牛的亲缘关系相对较远.PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyI Ⅱ结构域,为亲水性蛋白,有7个跨膜螺旋结构;其二级结构主要是延伸链,占31.83%;该蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白.qRT-PCR分析结果表明,PA QR3基因在广西巴马小型猪的不同组织中均有表达,以在肺脏中的表达量最高、脂肪中的表达量最低;经高脂高糖诱导后,PAQR3基因在广西巴马小型猪肝脏组织中的表达水平显著降低(P<0.05).[结论]PAQR3基因在广西巴马小型猪不同组织中广泛表达,在胆固醇和甘油三脂充裕的条件下,机体可通过下调PAQR3基因的表达量来平衡胆固醇含量.     

Cloning and sequence analysis of cDNA of leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1 (LAIR-1) gene in Guangxi Bama mini-pig

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3％、50.9％和49.9％.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征,采用问卷调查的形式,就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示,生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚,有着极大的开发空间,指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主,开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用,尤其是要注重媒体的宣传．     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。     

高校贫困生认定工作面面观

国家贫困生资助政策实施以来,对贫困生帮助很大,同时在实际运行中还存在着一些问题。本文提出贫困生认定工作仍需要进一步采取各种相关配套措施,以推动和保障贫困生资助工作更好地开展。     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

探究板栗的科学贮藏方法

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏。基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述。     

厚胶合板弹性模量预测模型

为了预测厚胶合板弹性模量,通过简化层合板理论,该文建立了胶合板弹性模量预测模型,并以单板条、经过涂胶热压处理的单板条和相同工艺条件下的单板层积材的弹性模量,采用4种不同铺层方式的19层桉树胶合板对模型进行了验证。结果表明:3种预测值与实测值的趋势一致,相关系数R2顺纹在0.86以上,横纹在0.88以上,但是精度不同。采用单板条弹性模量预测的胶合板弹性模量比实测值偏低;采用经过涂胶热压处理后的单板条弹性模量预测的胶合板弹性模量比实测值偏高;采用相同工艺条件下的单板层积材弹性模量预测的胶合板弹性模量与实测值偏差较小,顺纹平均误差为4.64%,横纹平均误差10.94%。因此,采用相同工艺条件下的单板层积材的弹性模量来预测胶合板的弹性模量是可行的。      

增强我国水果业出口竞争力的思考

分析了入世4年来,我国水果出口在量上实现了突破,但并没有实现质变的主要原因,指出我国水果业存在的问题。论述了引进外资对发展我国水果业的意义,并提出了具体可行的对策与建议。