分析基因差异表达的几种方法

随着人类和很多动物的基因组测序完成,以基因组功能研究为主要目标的后基因组时代的来临,基因功能信息的获取将成为基因研究的重点.基因差异表达分析是获取基因功能信息的重要方法.     

4种鼢鼠线粒体DNA D-loop区全序列分析

采用PCR测序技术对采自甘肃境内的4种鼢鼠22个个体的线粒体DAND-loop区全序列进行了测定。结果表明：鼢鼠线粒体DNAD-loop序列长度为893、894、895、896或899bp,核苷酸位点突变类型有5种,即转换、颠换、插入、缺失及转换与颠换共存。碱基转换以T〈=〉C形式为主。其中T、C、A、G4种核苷酸的平均比例分别为34．1％、24．3％、30．1％、11．5％,A＋T含量（64．2％）明显高于G＋C含量（35．8％）。这4种鼢鼠22条线粒体DNAD-loop区发现20种单倍型,单倍型比例为81．82％,说明中国鼢鼠mtDNA遗传多态性很丰富。从系统发育树分析,4种鼢鼠明显聚为两类,推测鼢鼠可能有两个起源。     

鸡蛔虫凉山州分离株线粒体ATP6基因的序列测定和种系发育分析

利用PCR技术,对分离自四川省凉山州17个鸡蛔虫分离株的线粒体ATP合成酶F0亚单位6基因(ATP6)的全序列进行扩增和分析。测序结果显示,所获得的鸡蛔虫ATP6全序列长度均为597bp,有25个变异位点,共检测到11个单倍型,种内变异为0.0~2.4%。种系发育树显示,所有鸡蛔虫分离株聚在同一分支,能与其他蛔虫相鉴别。结果表明,鸡蛔虫的ATP6基因序列种内变异小,种间差异大,故可作为分子标记用于鸡蛔虫的种间鉴定;鸡蛔虫凉山州分离株存在一定的遗传变异和遗传多样性。本研究结果为鸡蛔虫的分子分类、分子流行病学调查和种群遗传的进一步研究奠定了基础。     

蜜蜂线粒体ATPase6和ATPase8基因的克隆与序列分析

一、前言核酸序列分析是指通过测定核酸分子一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间的相互关系。从而阐明基因组ＤＮＡ一级结构上的遗传信息如何控制生物体三维形态发育和复杂性不断增加的动态发展过程,并从遗传角度对生物的分类体系、系统发育和进化作出解释。序列...     

猬裂头蚴线粒体nad4基因的克隆及序列分析

以从湖南长沙和湘西黑斑蛙大腿肌肉中采集的2条猬裂头蚴作为研究对象,用引物ND4F及ND4R扩增猬裂头蚴的pnad4片段,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,同时利用DNA Star5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示,来自湖南长沙和湘西的2条猬裂头蚴的pnad4序列均为640 bp。研究结果为猬裂头蚴进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。     

梅花鹿茸重相关基因差异表达分析

通过分析不同茸重梅花鹿茸的差异表达基因,筛选可用于区分鹿茸重量的基因。以东丰县梅花鹿为试验对象,同一饲养条件下,采集不同梅花鹿的茸血,进行高通量测序,对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析及qRT-PCR验证。结果表明：共有84个差异基因,其中,44个基因上调,40个基因下调。通过GO分析,这些基因共富集到318个条目,其中,分子功能118个、生物过程138个和细胞组分62个;通过KEGG分析,富集于细胞黏附分子(CAMs)、抗原加工递呈、Ⅰ型糖尿病等106条通路。通过P值筛选出8个基因进行qRT-PCR验证,趋势与测序数据相符,TRPC6基因在高产组的相对表达量高于低产组(P<0.01),有望成为筛选种公鹿的候选基因,为后续梅花鹿的良种选育提供理论基础。     

羊毛尾线虫线粒体nad4基因的序列变异分析

本研究旨在阐明中国羊毛尾线虫(Trichuris ovis)广东分离株线粒体NADH脱氢酶亚单位4(nad4)基因部分序列(pnad4)的遗传变异情况, 并用pnad4序列构建其与其他鞭虫的进化关系。应用PCR扩增羊鞭虫虫株的pnad4,将所获得的序列应用ClustalX 1.81程序进行比对,然后用Mega 5.0程序NJ法绘制种系发育树。本试验扩增所获得的pnad4序列长度一致,均为827 bp,种内变异在0~1.5%之间。种系发育分析结果表明,12个羊鞭虫分离株位于同一分支。由于羊鞭虫nad4序列种内相对保守,种间差异较大(37.8%~45.6%), 故可作为种间鉴定检测研究的遗传标记, 本研究结果为进一步研究羊鞭虫的群体遗传结构奠定了基础。     

中国地鼠线粒体D-loop基因的克隆及序列分析

本试验根据已知相近物种动物基因序列设计引物,PCR扩增获得中国地鼠线粒体D-loop基因序列。采用DNAStar软件计算序列碱基组成,分析遗传变异情况。用MEGA 4.1软件计算物种间遗传距离,采用邻接法(NJ)、最小进化法(ME)构建系统进化树。结果表明,中国地鼠线粒体D-loop区序列全长为867 bp,碱基A、T、C、G的含量分别为29.53%、31.49%、26.07%、12.92%,中国地鼠与啮齿类动物有相似的碱基组成。系统进化树结果显示,中国地鼠与金黄地鼠亲缘关系较近,与大鼠的关系最远,与传统的分类相一致。所获得的中国地鼠D-loop基因可作为种间遗传变异研究的标记,研究结果为进一步研究中国地鼠的群体遗传结构奠定了基础。     

ZBED6基因敲除猪肾脏转录组分析

【目的】探究锌指BED结构域结合蛋白6(zinc finger BED domain-containing protein 6,ZBED6)基因敲除对猪肾脏组织基因转录表达的影响,并解析ZBED6基因调控猪肾脏代谢的靶基因及其通路。【方法】对8月龄ZBED6基因敲除巴马香猪(ZBED6 KO)和同月龄野生型巴马香猪(WT)的肾脏组织(n=3)进行总RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和差异基因的表达量;以Illumina Hiseq高通量测序技术对ZBED6 KO和WT猪肾脏组织mRNA进行转录组测序(RNA-Seq),用猪Sus scrofa 11.1作为参考基因组序列,通过生物信息学软件TopHat、Cufflink、Cuffmerge和Cuffdiff对测序数据进行分析,筛选ZBED6 KO和WT猪肾脏组织中的差异表达基因,对差异表达基因进行层次聚类和KEGG通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果中差异表达基因的可靠性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,ZBED6 K...     

基于线粒体基因探讨甘肃地区4种绵羊的系统发育关系

研究旨在分析兰州大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊的系统发育关系,并与国内外其他绵羊品种进行比较.试验分别对甘肃地区兰州大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊等4种绵羊品种进行线粒体基因COX1与Cytb基因序列的扩增和产物的测序,并基于COX1与Cytb基因与国内外其他绵羊品种构建发育树,分析种群遗传现状和系统发育关系.结果显示,4种绵...     

小眼高原鳅线粒体DNA细胞色素b基因序列分析

对小眼高原鳅线粒体DNA细胞色素b基因进行了PCR扩增、克隆及其序列测定，得到全序列长度为1140bp,其T、C、A、G含量分别为362(31.8％)、291(25．5％)、301(26．4％)、186(16．3)，GC含量41．8％。分子质量为349782。     

甘南牦牛线粒体DNA?Cytb基因序列分析

为深入研究线粒体DNA Cytb基因对牦牛在低氧环境适应性中的作用,本研究克隆获得甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因全序列,并对其理化性质进行分析。获得甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因全序列1 140 bp,编码379个氨基酸,编码产物分子质量98.5 KD,理论等电点为4.98,是亲水性的稳定蛋白,存在明显的碱基AT使用倾向性,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

4猪种Nramp1基因第6内含子多态性研究

天然抗性巨噬蛋白(Nramp)基因是与人、鼠的一些病原微生物的易感性和抗性有关的重要候选基因。为了研究猪Nramp1基因的多态性,利用PCR-RFLP技术检测了杜洛克、大白猪、长白猪和合作猪共270头个体Nramp1基因第6内含子NdeⅠ酶切位点多态性。结果表明,4个猪种群共检测到3种基因型(AA、AB和BB),其中AB基因型为杜洛克、大白猪和长白猪的优势基因型;AA基因型为合作猪的优势基因型。经卡方适合性检测,杜洛克、合作猪和长白猪处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),大白猪处于Hardy-Weinberg不平衡状态。多态信息含量分析显示,Nramp1基因的第6内含子NdeⅠ酶切位点在各猪种表现出中度多态性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

将猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒BJ－4株在HS．2H细胞上增殖，经超速离心浓缩病毒。用TRIXOL LS试剂提取病毒基因组RNA后，用RT－PCR方法特异性扩增PRRS病毒BJ－4的ORF6基因片段；经Sma Ⅰ酶切鉴定正确后，将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体上，经Amp/IPTG/X-Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒PCR鉴定，初步获得含ORF6基因的阳性重组质粒pGEM-T-ORF6。对重组质粒进行序列测定，并同美洲代表株VR2332和欧洲代表株LV进行比较，结果表明，BJ－4 ORF6与VR2332的ORF6差异较小，核苷酸和氨基酸同源性均为99．43％；而与LV株的差异性较大，核苷酸同源性为70．6％，氨基酸同源性77．4％。     

长白猪IL-6基因的克隆及其序列分析

用PHA和LPS诱导猪脾和淋巴结淋巴细胞，提取细胞总RNA，利用RT—PCR技术克隆猪1L-6的cDNA并进行序列测定与分析。测序结果及同源性分析表明，已扩增到IL-6基因，大小约为669bp，含有1个639bp的开放阅读框，编码212个氨基酸，其中前28个氨基酸为信号肽，且碱基序列在不同种属动物间差别较大。分组诱导表明，LPS效果更佳，PHA和LPS联合诱导能使更多的IL-6转录表达。     

A群猪轮状病毒JS株VP6基因序列分析

参考GenBank中发表PRV OSU毒株VP6序列ORF两端保守区,设计1对特异引物,以PRVJS株反转录cDNA为模板,通过PCR方法获得约1.3 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:获得了VP6的1 320 bp全基因序列;将其ORF与国内外9株PRV VP6基因的ORF进行核苷酸和氨基酸同源性比较,核苷酸同源性在77.1%~91.1%之间,氨基酸的同源性在89.7%~99.5%之间;在氨基酸系统发育进化树中,JS毒株与A131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

牦牛Myf6基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在克隆牦牛Myf6基因,进行生物信息学分析并探究其在牦牛不同时期的表达情况。以青海雪多牦牛为研究对象,通过设计引物对其Myf6基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测研究。结果显示,牦牛Myf6基因含有一个大小为729 bp的开放阅读框（ORF）,编码242个氨基酸。同源性比对和进化树分析结果表明,牦牛Myf6氨基酸序列与普通牛、绵羊亲缘性最近。对Myf6蛋白理化性质进行预测分析得到其结构式为C₁₁₆₇H₁₈₇₀N₃₃₆O₃₇₂S₁₃,理论等电点为5.64,其中丝氨酸含量最高,其次是亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸;其疏水平均值为-0.586,亲水性最强为-2.467,疏水性最强为1.511,为亲水性、可溶性蛋白;有可形成卷曲螺旋部位;磷酸化位点预测其有26个丝氨酸激酶,10个苏氨酸激酶,5个酪氨酸激酶;亚细胞定位分析其编码产物在细胞核中分布最多（73.9%）,其次为细胞骨架（13.0%）、细胞质（4.3%）、高尔基体（4.3%）、分泌系统小泡（4.3%）。蛋白质二级结构主要由无规则卷曲（49.17%）组成,其次是α-螺旋（33.47%）、延伸连（11.57%）及β-折叠（5.79%）。蛋白功能分析显示其生长因子功能几率较大（7.694）,其次为转录调节作用,预测其作为一种生长因子参与机体生物学调控。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在胎牛、6月龄、4~5岁牦牛背最长肌中均有表达,且在6月龄的表达量显著高于胎牛和4~5岁牦牛（P<0.05）。上述结果为研究牦牛Myf6生肌因子提供了重要的研究数据,为改良牦牛经济性状提供了参考。     

牛源IL-6基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆牛白细胞介素-6（IL-6）基因，并对其编码蛋白进行生物信息学分析，对荷斯坦奶牛进行尾根采血提取RNA后逆转录为cDNA，根据NCBI数据库中已知的牛IL-6基因mRNA序列设计特异性引物，应用RT-PCR技术克隆得到CDS区全长序列，利用生物信息学软件分析牛IL-6基因序列特征、同源性及编码产物的理化性质等。结果表明，试验成功克隆了牛IL-6基因CDS区，全长627 bp，分子质量为23.759 ku，共编码208个氨基酸，理论等电点为7.58，脂溶系数为93.37，属于亲水性蛋白；牛IL-6基因与猪、绵羊、大鼠、人、猫、犬、鸡、小鼠、马和兔的同源性分别为84.4%、96.2%、66.7%、77.5%、75.9%、79.3%、48.5%、67.0%、79.5%和67.5%；系统进化树分析发现，牛与绵羊亲缘关系最近，猪次之，鸡最远；在二级结构预测中，该蛋白无规则卷曲与α-螺旋分别为34.6%和60.1%；亚细胞定位于细胞质；该蛋白含有信号肽和跨膜螺旋结构。本研究为进一步分析牛IL-6基因的功能奠定了一定的理论基础。     

黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因的克隆及全序列分析

采用PCR克隆技术对黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因进行克隆、测序。黑熊四川亚种线粒体DNA cytb基因的全序列为1140 bp,CG含量为46.23％。与AB020910和U23558两个黑熊cytb序列的变异共有61处.其中T-C转换共有36处.A—G转换共有23处。仅有2处发生T-A颠抉,碱基突变率为5.35％.其中转换率96.72％,颠换率为3.28％。密码子第3个碱基发生变异的有48个。     

金丝猴毛首线虫线粒体cox1基因序列分析

为阐明金丝猴毛首线虫线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基（cox1）基因部分（pcox1）序列的遗传变异情况,以长沙生态动物园金丝猴体内分离的毛首线虫作为研究对象,根据cox1序列构建其与其他毛首线虫的进化发育关系。使用PCR方法扩增金丝猴毛首线虫线粒体cox1,然后将所测得的序列应用Clustal X 1.81程序进行比对,最后用Mega 5.0程序NJ法绘制种系发育树。结果显示,本实验扩增获得的6条毛首线虫分离株cox1序列长度一致,均为411 bp,种内变异为0。种系发育分析结果表明,这6条毛首线虫分离株位于同一分支。鉴于金丝猴毛首线虫的cox1基因种内保守,而种间差异大（24.0%~34.1%）,因此可以作为种间鉴定检测研究的遗传标记。本研究结果为进一步研究金丝猴毛首线虫的群体遗传结构奠定了基础。