猪群常见疫病混合感染情况调查

为了解广西部分县市猪群常见疫病流行情况,本次调查通过RT-PCR或PCR方法,对采集到的26份病料进行病原学检测,主要检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、乙脑病毒(JEV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。结果显示,抽检地区猪群多发生混合感染,以3重或多重感染为主,疫病潜在流行态势较为复杂。     

双重RT-qPCR鉴别CSFV和BVDV方法的建立及初步应用

为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。     

CSFV与PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的RT-PCR方法,根据CSFV和PRRSV的保守区域各设计1对特异性引物,预期扩增片段大小分别为356和546 bp,通过对反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,建立了CSFV和PRRSV的双重RT-PCR方法。结果显示:该方法能特异检测CSFV和PRRSV的cDNA最低量分别为0.96、1.48 ng,而对猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒(PCV)检测结果均为阴性;利用建立的双重RT-PCR对云南省部分地区送检的174份疑似CSFV及PRRSV感染的病料进行检测显示,CSFV感染率为24.14%,PRRSV感染率为47.70%,CSFV与PRRSV的混合感染率为16.67%,检测结果与单一RT-PCR结果相一致,且具有良好的可重复性;利用免疫组织化学方法对部分检测结果加以验证,验证结果与检测结果均一致。本研究成功建立了CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法,为二者的快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效手段。     

SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测

采用RT-PCR方法对37份疑似猪流感病毒(SIV)感染病料进行了病原学检测。同时,还运用PCR和RT-PCR方法对SIV阳性病料进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)目的基因片段的扩增。结果,扩增出了SIV特异目的基因片段,且4份病料都为混合感染,感染状况分别为SIV/PRRSV/PRV,SIV/CSFV/PRRSV三重感染,SIV/PCV-2和SIV/PRRSV二重感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

近年来云南省部分猪场病毒性猪繁殖障碍性疾病混合感染的病例分析

为了及时了解云南省养猪场的病毒性猪繁殖障碍性疾病混合感染的情况,试验采用PCR与RT-PCR方法检测了2013年5月份至2015年4月份325份来自云南省部分猪场患繁殖障碍病猪的病料。结果表明:有3份样品为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)的混合感染;有3份样品为PRRSV与猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV-2)的混合感染;有1份样品为CSFV与PCV-2的混合感染;有1份样品为CSFV、PRRSV与PCV-2的混合感染。说明云南省猪病的混合感染情况不多见。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立和初步应用

根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因序列,进行对比分析,分别设计合成两对能特异性扩增CSFV、BVDV的引物。经过条件优化后,建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为938、650 bp。应用该方法对11批牛睾丸细胞、7批胎牛血清、60个批次的猪瘟细胞苗、10份全血样及10份组织样进行检测。通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV鉴别诊断提供了有效方法。     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。