链霉菌769与百日草黑斑病病菌诱导百日草几丁质酶基因的表达差异

以百日草为试验材料,利用同源基因克隆法克隆到百日草几丁质酶基因片段和actin基因片段,分别用链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液处理百日草植株,通过半定量RT-PCR检测了不同处理的几丁质酶基因表达量的差异.结果表明,链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液均能诱导百日草几丁质酶基因的表达,其最大表达量分别在接种后24 h和6h.百日草黑斑病病菌优先诱导植株体内几丁质酶的表达,而链霉菌769的诱导滞后.当用病原菌处理36 h后喷施链霉菌769发酵液,链霉菌769对几丁质酶基因的诱导表达高峰出现在喷施后的36 h,比单独喷施的诱导表达推迟了12h,暗示了生防菌链霉菌769可以诱导植物的系统诱导抗性,且和百日草黑斑病病菌引发了不同的信号转导通路,以减轻由病原菌侵染引发的植物病害.     

具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达

 本研究通过平板透明圈法筛选获得一株具有几丁质酶活性的生防细菌CAB-1,该菌株对番茄灰霉病菌等多种病原真菌表现较强的拮抗活性。通过生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列测定,将菌株CAB-1鉴定为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）。对菌株CAB-1全基因组序列进行分析和功能预测,发现该菌株存在2个几丁质酶编码基因chit1和chit2。通过PCR技术从菌株CAB-1中克隆出这两个几丁质酶的编码基因并在大肠杆菌中表达,其原核表达产物均表现几丁质酶活性,其中chit1的原核表达产物能够显著抑制灰霉菌分生孢子的萌发。对其原核表达条件进行优化,发现在30℃下振荡培养24 h,IPTG浓度为0.2~1.0 mmol/L时,其蛋白表达量最高。     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

木霉几丁质酶及其对植物病原真菌的拮抗作用

 木霉(Trichoderma spp.)作为重要的植病生防因子(biocontrol agents)一直受到普遍关注。木霉菌株产生的包括几丁质酶在内的细胞壁降解酶,在木霉重寄生中起重要作用。本文论述木霉几丁质酶的种类、诱导产生、理化特性及其对植物病原真菌的拮抗作用,并对木霉几丁质酶及其基因的生防应用进行讨论。     

茶炭疽病拮抗链霉菌的筛选鉴定与拮抗能力测定

茶炭疽病是茶树的一种重要叶部病害,发生时严重影响茶叶产量和品质,给茶叶生产带来经济损失。为获得对茶炭疽病菌刺盘孢菌Colletotrichumcamelliae具有良好拮抗效果的链霉菌,采用稀释涂布平板法从茶园根际土壤中分离放线菌菌株,利用平板对峙法筛选具有较高拮抗活性的菌株;结合其形态特征、培养特征、生理生化特性和分子生物学对其进行种属鉴定;采用扫描电镜观察菌株JS4-F对茶炭疽病菌的生长抑制作用,离体叶片法和盆栽防效测定其发酵液对茶炭疽病的室内防治效果,平板对峙法测定其抗菌谱。结果表明,分离筛选获得一株对茶炭疽病菌具有较好拮抗作用的菌株JS4-F,根据该菌的形态特征、生理生化特性初步将其鉴定为链霉菌属,通过联合16S rRNA、gyrB、ropB、recA、trpB基因测序结果构建系统发育树,JS4-F菌株被鉴定为藤黄生孢链霉菌Streptomyces luteosporeus。菌株JS4-F对茶炭疽病菌的拮抗效果达75.59%,扫描电镜表明其能使茶炭疽菌菌丝畸形、皱褶、菌丝之间相互缠绕;氮源利用试验表明,菌株JS4-F能利用L-精氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸,能在6%...     

几丁质酶基因和β-1.3-葡聚糖酶基因的克隆及双价基因在枯草芽胞杆菌B-908中的表达

 本文综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的研究历史及特点,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的分子生物学方面研究进展,以及几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在植病生防方面的应用概况。以几丁质酶产生菌粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和β-1,3-葡聚糖酶产生菌环状芽孢杆菌Bacillus circulans为供体菌株,提取其染色体DNA。经Sau3 Al部分酶切后,插入克隆质粒pUC19,分别建立了几丁质酶基因文库和β-1,3-葡聚糖酶基因文库。     

拮抗链霉菌R15β-葡萄糖苷酶的纯化及特性研究

 从山东泰安郊区大白菜植株根际土壤中分离筛选获得一株拮抗链霉菌(Streptomyces spp. )R₁₅菌株。采用固体发酵、粗酶液 (NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析和Sephadex G75凝胶柱层析等步骤从链霉菌(Streptomyce spp.)R₁₅中分离纯化获得β-葡萄糖苷酶。结果表明, 纯化倍数16.28, 回收率为14.59％, SDS-PAGE电泳测得相对分子量为63.89 kDa。经TLC分析酶解产物, β-葡萄糖苷酶与水杨苷反应生成D-葡萄糖和水杨醇。以水杨苷为底物时, 该酶的Km值为10.644 mmol/L, Vmax为0.525 μmol·L^-1·min^-1。该酶的最适温度为65℃, 70℃以下相对稳定;最适pH为5, pH 3~7之间相对酶活在75％以上。Cu²⁺、Hg²⁺和Fe²⁺对酶有抑制作用, 其中Hg²⁺和Cu²⁺的抑制作用最强, 酶活力完全丧失;而Ca²⁺, Mn²⁺对酶均有激活作用, 相对酶活分别高达137.18%和119.52%。     

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

 通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T₀和T₁代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。     

绿色木霉几丁质酶基因Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析

 利用RT PCR方法从绿木霉ZBS 6中扩增了几丁质酶基因Tvchi,序列分析表明Tvchi 开放阅读框为1 293 bp,编码430个氨基酸残基,Blast 分析表明,与多种木霉18家族内切几丁质酶具有较高的同源性。将该基因克隆到原核表达载体pET 28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS PAGE和Western印迹分析表明成功的获得了47 kD 的融合蛋白。该融合蛋白经Ni NTA柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白Tvchi。Tvchi最适酶活温度为37℃,最适酶活pH值为6.8。表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为进一步研究木霉几丁质酶的应用提供了基础。     

链霉菌菌株HNS2-2的分类鉴定及其代谢产物抗烟草花叶病毒活性

从神农架国家自然保护区土样中分离筛选到1株抗烟草花叶病毒的放线菌HNS2-2。根据培养性状、扫描电镜观察、生理生化测定以及16S rRNA序列分析,初步判定该菌株为链霉菌属中的草绿色链霉菌（Streptomyces herbaricolor）。HNS2-2菌株培养滤液与烟草花叶病毒混合后接种在枯斑寄主曼陀罗和系统侵染寄主普通烟K326上,对两寄主的枯斑抑制率分别为92.62%和61.88%;接种病毒前、后施用HNS2-2菌株培养滤液对两寄主的枯斑抑制率分别为83.78%、67.26%和54.06%、42.37%。     

中华根瘤菌L03几丁质酶纯化及其酶学性质研究

中华根瘤菌Sinorhizobium sp.菌株L03是1株能产生几丁质酶的生防细菌.采用90%饱和度硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等方法获得了菌株L03的几丁质酶.SDS-PAGE检测发现该酶已被纯化,其分子量约为41.3kD.该酶反应的最适温度为45℃;最适反应的溶液pH值为6;酶液在pH5～8条件下和40℃下分别保存1h,酶活力基本保持稳定;Mg2+和Ba2+能显著促进几丁质酶活性上升,而Zn2+、Cu2+和Fe3+等对酶活力有明显的抑制作用.功能分析结果显示,该几丁质酶对供试的几种病原真菌细胞壁都有明显的降解作用.     

木霉几丁质酶对烟草赤星病菌的作用

以指形管培养法分别测定几丁质酶粗酶液和纯化的几丁质酶混合液(2种几丁质酶)对烟草赤星病菌孢子萌发的抑制作用。结果表明,较高浓度(25 2U)几丁质酶粗酶液在48h内强烈抑制孢子萌发和芽管伸长,或致芽管畸形和细胞壁破裂;几丁质酶混合液对赤星病菌的孢子萌发也表现出明显的抑制作用,但在相同或相近酶活性条件下,纯化的几丁质酶混合液(9 4U)和粗酶液(12 6U)对赤星病菌孢子萌发的抑制率(处理24h时)分别为46%和84 3%,前者明显低于后者。采用孢子液悬滴法接种烟苗(K 326)叶片测定木霉几丁质酶对赤星病菌致病性的影响。结果表明,几丁质酶粗酶液浓度越高,对孢子萌发抑制时间越长,抑制率越高;其浓度为4 9、9 8、19 5U/ml的抑制率7d时分别为36 8%、56 2%和57 6%。     

An Endophytic Actinomycete, Streptomyces sp. AOK-30, Isolated from Mountain Laurel and Its Antifungal Activity

To survey endophytic actinomycetes as potential biocontrol agents against fungal diseases of mountain laurel, young plants of mountain laurel (Kalmia latifolia L.) were used as an isolation source. From a total of 73 actinomycetes isolates obtained from leaves, stems and roots of test plants, Streptomyces sp. AOK-30 was selected, because i) it had a broad and intense antimicrobial spectrum against various yeasts and fungal pathogens of Ericaceae, ii) it grew on the multiplication and rooting media for tissue culture for this plant, and iii) the tissue-cultured seedlings that had been treated with this isolate became resistant to Pestalotia disease without any adverse growth effects such as malformation, dwarfing, discolorization and defoliation. This isolate was identified as Streptomyces sp., based on cultural, physiological and morphological characteristics. The present results indicate that isolate AOK-30 is a potential biocontrol agent against diseases of mountain laurel. Received 10 September 2002/ Accepted in revised form 22 November 2002     

烟草黑胫病和根黑腐病生防假单胞杆菌的筛选与鉴定

为获得对烟草黑胫病和根黑腐病具有双重防病效果且能够促进烟草生长的假单胞杆菌,采用稀释涂布法从40份土壤样品中分离出201株细菌,通过平板对峙和含毒介质法,筛选出对烟草黑胫病和烟草根黑腐病病原菌均具有良好拮抗作用的菌株PA2101和PG3402。盆栽促生试验表明,菌株PA2101和PG3402能协调地改善烟草地上部分的生长和烟草根系发育,均在一定程度上增加了烟草的株高、叶面积、株鲜重、根鲜重、叶片数和根长,提高了烟草的根冠比和根活力。盆栽试验结果表明,菌株PA2101对烟草黑胫病和根黑腐病的防效分别为70.11%和62.67%,均高于其对照药剂;菌株PG3402对两种病害的防效分别为60.92%和60.00%,与对照药剂相当。抗性标记菌株的定殖试验结果表明,菌株PA2101和PG3402在接种后第29 d能定殖于烟草根际土壤和根内,在烟草茎和叶内也能长时间存在,表明两菌株能够良好定殖。16Sr DNA序列、菌落形态和生理生化性状分析表明,菌株PA2101为铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa,菌株PG3402为格拉纳达假单胞杆菌Pseudomonas granadensis。综上所述,菌株PA2101和PG3402对烟草具有良好的促生作用,并对烟草黑胫病和根黑腐病有较好的防病效果,是具有生防潜力的菌株。     

链霉菌182-2抗真菌活性物质的分离及抑菌特性的初步研究

[目的]链霉菌182-2的发酵液对烟草赤星病有良好的抑制作用,本文拟对其发酵液中抗真菌活性组分进行初步分离,并进行抑菌特性研究.[方法]发酵液经预处理后,依次用活性炭脱色,大孔树脂吸附层析分离纯化,对纯化后活性物质(组分Ⅱ)的抑菌活性进行测定.[结果]分离纯化结果表明其活性物质中至少含有两种抗真菌活性组分.离体条件下当活性物质浓度为2 000μg/mL时,对烟草赤星病菌有很强的抑菌作用,抑菌圈直径达58.0mm.目测法测定抗生作用表明其最小抑菌浓度(MIC)为80 μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为160μg/mL.48 h时对菌丝生长和孢子萌发的抑制率最高,抑菌中浓度(EC50)分别为31.9 μg/mL和42.2μg/mL.活性组分处理还可导致病原菌菌丝和孢子萌发产生的芽管变形扭曲或产生大泡囊.[结论]纯化后的活性物质对烟草赤星病菌具有较强的抑制作用,有进一步研究利用的价值.     

链霉菌XG40的鉴定及其对琯溪蜜柚黑斑病的防效

为筛选出对琯溪蜜柚黑斑病菌有拮抗效果的生防菌株,本研究采用平板对峙法和牛津杯法分离筛选植物根际土壤放线菌,共分离纯化得到12株能够拮抗蜜柚黑斑病菌Phyllosticta citriasiana的放线菌菌株,其中菌株XG40对蜜柚黑斑病菌的拮抗能力最强,抑菌带宽度为16.3 mm。根据形态特征、生理生化特征以及16S rDNA、recA、rpoB、gyrB序列分析,将菌株XG40确定为小串链霉菌Streptomyces catenulae。抗菌谱试验结果表明,菌株XG40的发酵液对番茄叶霉病菌、蜜柚炭疽病菌、蜜柚黑点病菌等12种植物病原真菌和2种植物病原细菌也有较好的拮抗作用,抗菌性能广谱高效。菌株XG40对黑斑病菌的抑菌机制表现为受抑制菌丝发生畸变、粗细不均匀、大量断裂,其发酵液能使黑斑病菌孢子内含物消解并产生液泡。防效测定结果表明,菌株XG40发酵液对室内离体果实黑斑病的预防效果和治疗效果分别为83.52%和78.87%;对田间果实黑斑病的预防效果和治疗效果分别为78.91%和71.15%。因此,菌株XG40可作为防治蜜柚黑斑病的生防材料,具有良好的开发价值和应用前景。     

抗香蕉枯萎病菌拮抗菌的鉴定及其定殖

通过逐步提高药物浓度方法,获得了抗利福平400μg/ml、对香蕉枯萎病菌拮抗活性稳定的T2WF和W10标记菌株。初步确定两菌株为芽孢杆菌属细菌。采用灌根接种法,在香蕉苗根际土和香蕉苗体内定殖结果表明,拮抗菌液接种浓度为5×104cfu/ml,两菌株均可从香蕉根际土和香蕉体内分离到,并在香蕉体内定殖和传导。在香蕉根际土、根部、球茎和假茎中,T2WF标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、5、11和3d,分别为707、437、273、117cfu/mg;而W10标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、3、5和5d,分别为784、260、253、110cfu/mg。两菌株在香蕉根际土和香蕉体内1~15d的消长动态均有一个共同的“由升到降”趋势。从数量和数量变动幅度上看,香蕉根部的菌量明显高于茎部的菌量。