不同栽培模式韭菜田韭菜迟眼蕈蚊和葱黄寡毛跳甲的种群动态

于2013-2014年采用成虫诱捕法和挖根取样调查法,对不同栽培模式下韭菜田中韭菜迟眼蕈蚊和葱黄寡毛跳甲成虫的种群动态及发生世代进行系统调查。结果表明:韭菜迟眼蕈蚊在不同栽培模式中周年可发生5~6代,受温湿度影响,设施栽培地比露地中韭菜迟眼蕈蚊发生周期长、发生量大,盛发期主要分布于春、秋和冬3个季节,夏季未发现;葱黄寡毛跳甲成虫周年发生期集中于温湿度适宜的4月中旬至11月上旬,其中温度高、湿度大的8月发生数量少、为害轻。     

对甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株筛选

依据对夜蛾科具有高毒力cry基因的序列,设计特异性引物对实验室保存的对鳞翅目害虫高效的菌株资源进行筛选。通过比较质粒图谱,对其多样性进行了研究。进一步测定Bt菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株。从192株菌株中筛选出15株对夜蛾科害虫具有高活性的菌株,包含的基因类型有:cry1A、cry1C、cry2A、cry9和vip3A类基因,晶体形态包含:双锥体形、方形、球形;其中2株菌表达130ku和60ku的蛋白,1株菌表达130ku和70ku的蛋白,其余菌株均表达约130ku的蛋白;这15株菌通过质粒图谱分析分为8种类型;3株菌对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力,其中菌株PS3-C2对甜菜夜蛾LC50为1.87μg/mL。本研究成功筛选出对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株3株,其中PS3-C2菌株与对照菌株KN11活性相当,为新型杀虫基因分离克隆与制剂的研发奠定了基础。     

Bt菌株FB的生物学特性及其cry、vip基因型鉴定

菌株FB是1株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）。本研究通过扫描电子显微镜、大质粒电泳、总蛋白SDS-PAGE及菌株生长特征观察的方式研究了菌株FB特征,克隆得到了基因cry1Ia、cry1Ea、cry1Ab、cry2Ab和vip3Aa全长,依据全基因组测序结果得到了1个cry8基因部分片段,首次在Bt菌株中同时发现基因cry1类和cry8类,这五种基因推导的氨基酸序列与已知基因序列相比,最高相似性分别为99%、98%、99%、100%、99%,而cry8半长基因与已知基因仅为63%。生测结果表明,蛋白Cry1Ia、Cry1Ea和Cry1Ab对小菜蛾幼虫具有较高杀虫活性。     

杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定

自烟草中分离获得对南方根结线虫Meloidogyneincognita具有较高杀线活性的拮抗细菌菌株YC-10。研究发现该菌株有伴胞晶体产生,菌体、芽胞形态及生理生化特性与苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种B．thuringiensissubsp．kurstaki相似,16srDNA序列分析表明其与苏云金芽胞杆菌相似性最高,初步确定该菌株为苏云金芽胞杆菌。菌株发酵液及伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2有很强的杀线活性,发酵液处理南方根结线虫,24h线虫死亡率为100％;伴胞晶体蛋白处理南方根结线虫,24h的LC50为5．86μg．mL^-1。研究结果显示该菌株在线虫生物防治上有较大的应用潜力。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析

为筛选对黏虫[Mythimna separata(Walker)]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白,本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白,通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明,Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性,其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93μg/g;Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用,其浓度为10μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%,浓度为100μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%;Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础,并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫,给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害.为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控,亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源.本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株,基于菌株杀虫基因差异及进化关系,去除冗余菌株后获得172株候选菌株.通过...     

苏云金芽胞杆菌GS8菌株的生物学特性及其cry基因型鉴定

采用桑叶浸渍法和饲料表面覆盖法测定发现,从土壤中分离的一株苏云金芽胞杆菌菌株GS8对家蚕Bombyx mori、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和棉铃虫Helicoverpa armigera初孵幼虫均表现出较高的杀虫活性,经形态学和生理生化反应鉴定该菌株为东北亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tohokuensis)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,GS8菌株的杀虫蛋白晶体主要由分子质量为130、81和60 kDa的蛋白组成。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定结果显示,GS8菌株含有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ib、cry2Ab和cry9Ba 等基因。     

四种Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫毒力测定及中肠组织病理学变化

为更好地了解苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis毒素蛋白对二点委夜蛾Athetis lepigone的毒力以及作用机理,通过饲喂含有Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab和Vip3Aa四种不同Bt毒素蛋白饲料,测定Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的毒力,并观察取食4种毒素蛋白后幼虫中肠组织的病理学变化。结果显示,二点委夜蛾幼虫取食毒素蛋白后72 h,Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性较高,校正死亡率为84.7%和76.4%;Vip3Aa和Cry2Ab毒素蛋白的毒力较弱。二点委夜蛾幼虫取食4种Bt毒素蛋白后,中肠柱状细胞微绒毛脱落,杂乱地分散在肠腔内,杯状细胞变形和腔内微绒毛脱落,线粒体和内质网等变形破裂,细胞核的核膜消失、核质凝聚和形状发生变化,经Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白处理后中肠细胞的病变症状和速度明显高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白处理。表明Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫杀虫活性较高,显著高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白,且对其中肠细胞的破坏作用也较强。     

蓖麻枯萎病菌高效生防菌株LX1的筛选与鉴定

为筛选对蓖麻枯萎病菌Fusarium oxysporum Schl.具有抑制活性的生防菌株,本研究利用利福平选择性培养法,从花生根际土壤中筛选了一株对蓖麻枯萎病菌具有显著抑制活性的菌株 LX1。菌株 LX1在对峙培养中出现了明显的抑菌圈,孢子萌发试验显示孢子萌发抑制率为55%～78%,普通光学显微镜观察显示,菌株LX1可显著抑制F. oxysporum菌丝生长,明显造成菌丝分支增加,部分菌丝顶端和中央膨大,随着时间的延长,畸变结构和程度加剧。通过对菌株LX1的形态特征、染色反应、培养性状、生理生化测试以及16S rDNA分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。本研究结果为菌株LX1应用于蓖麻枯萎病菌的生物防治及生物制剂的开发提供了依据。     

对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展

半翅目害虫寄主范围广、危害时间长, 给我国农林业生产带来了严重的经济损失。应用有效的绿色防控手段替代化学杀虫剂防治半翅目害虫, 对于保障粮食安全生产、保护动物及人类生命健康、维护生态平衡具有重要意义。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis产生的杀虫蛋白对多种害虫展现出高效特异的杀虫活性, 对非靶标生物安全, 为全球农业、林业和卫生害虫的绿色防控做出了突出贡献。本文综述了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、危害特点及主要防治手段, 重点归纳了Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性研究进展以及挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白基础, 并针对Bt杀虫蛋白在半翅目害虫绿色防控方面的应用提出了建议。     

小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展的研究

使用苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（Btk）可湿性粉剂对小菜蛾进行继代汰选获得F80代和F100代抗性品系。通过分别测定Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca四种杀虫晶体蛋白对小菜蛾Btk抗性品系F80代和F100代的室内毒力,明确了小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展规律。研究结果表明,汰选至F80代时,Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC50约12.1mg/L,其次为Cry1Ac,LC50约47.7mg/L;而汰选至F100代时,仍以Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC50约21.4 mg/L,其次为Cry1Ab,LC50约72.2 mg/L。与相对敏感品系相比,小菜蛾抗性品系对Cry1Ac的抗性发展较快（抗性倍数高达67.3～106.8倍）,对Cry1Ab的次之（抗性倍数高达60.0～66.1倍）,而对Cry1Ca和Cry1Ah的抗性发展较慢（抗性倍数分别为3.4～6.0倍和1.6～2.5倍）。以上结果说明,在主效杀虫基因为Cry1Ac的Btk药剂选择压力下,小菜蛾对四种Bt杀虫晶体蛋白的抗性发展速度差异较大,且Cry1Ac和Cry1Ab存在交互抗性风险...     

烟草叶围细菌Tpb55菌株的鉴定及其抑菌活性

Tpb55是从烟草叶面生境中分离获得的一株拮抗细菌,本研究从形态、生理生化、16S-23S rDNA转录间隔区PCR（ITS-PCR）分析,初步明确了该菌株的分类地位。光学显微镜下观察到Tpb55菌体为杆状,革兰氏染色均匀,鞭毛周生,产芽孢,各项生理生化测试指标与枯草芽孢杆菌菌株表现一致;16S-23S rDNA ITS-PCR分析结果表明,Tpb55与枯草芽孢杆菌同源性达到99.75%。Tpb55代谢产物对7种病原真菌和3种病原细菌均有不同程度的抑菌作用,表明该菌株代谢产物具有较高的抑菌活性和较广的抑菌谱。进一步研究发现,该菌株代谢产物对有机溶剂、蛋白酶、热和pH值都有很高的稳定性,是具较好开发潜能的生防菌株。     

夜蛾科昆虫高毒力苏云金杆菌菌株的分离和筛选

从山东省采集的750份土样中分离出苏云金芽孢杆菌菌株57株,这些菌株的晶体形态主要有菱形、圆形等。以夜蛾科害虫粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫,通过生测筛选出一株高毒力菌株QCL-1。菌株QCL-1对甜菜夜蛾的毒力显著高于标准菌株HD-1,对粘虫的毒力与HD-1相当。     

对暗黑鳃金龟成虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选

暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC₅₀为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC₅₀为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。