猪细小病毒SX株的分离鉴定

从发生蓝耳病的猪场采集流产、死胎病料中分离出了一株病毒,适用传代细胞后,该病毒能够在ST细胞上生长并引起明显的呈拉网状和细胞脱落的细胞病变(CPE),能够凝集0.5%的豚鼠红细胞,经猪细小病毒阳性血清中和后不能引起细胞病变(CPE),也失去了血凝特性;用特异荧光抗体染色可见细胞核内出现特异性荧光.采用特异性PPV NS1基因的引物进行扩增,得到了大小约为2.18 kb的片段,测序并与猪细小病毒相应序列进行比较,同源性为99%以上,鉴定该病毒为猪细小病毒,命名为PPV-SX.说明目前有部分猪繁殖障碍是由猪细小病毒和PRRS共同感染而致.     

一株猪细小病毒的分离与鉴定

取疑似猪细小病毒(PPV)流产胎儿组织病料,处理后接种PK-15传代细胞,2~4 d后出现了明显的细胞病变;荧光抗体试验结果显示,PPV呈现阳性;以猪细小病毒VP2基因的1对特异性引物,从PPV疫苗、流产胎儿病料及感染细胞培养物中PCR扩增出158 bp的DNA条带;扩增产物经EcoRⅠ酶切分析,得到了预期的条带(123 bp和35 bp),从而证实PCR方法的特异性;敏感性试验结果显示,PCR的最小检出量为300 pg。研究结果表明,2006年9月发生在贵州省某种猪场的疫情确由猪细小病毒感染所致。     

猪细小病毒的分离与鉴定

贵州某猪场发生一起以初产母猪产弱仔、死胎、畸形胎、木乃伊胎为特征的疫病,根据病毒的分离与鉴定,确诊此次疫病为猪细小病毒感染所致。     

猪细小病毒的分离与鉴定

本试验从福建省某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到1 株病毒。病料接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等细胞病变,猪细小病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。根据已发表的细小病毒(PPV) VP2基因的序列设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增531 bp DNA片段。测序结果表明,分离株VP2基因与NCBI公布的NADL-2株的同源性高达99.2％,证实分离的病毒株为猪细小病毒。为进一步开展该病毒致病机理、流行病学、诊断研究与疫苗免疫等奠定了基础。     

犬细小病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定

为研究犬细小病毒(CPV)生长规律,利用F81细胞从四川地区疑似CPV感染的病犬血样粪便中分离得到1株CPV,对该株病毒进行理化试验、微量中和试验、PCR鉴定以及分子生物学系统鉴定后,证实该分离株是CPV,命名为SC-C。以SC-C分离株感染F81细胞,感染后不同时间收取上清,利用CPV荧光定量PCR检测方法对不同样品中病毒DNA进行定量分析,绘制CPV一步生长曲线。结果显示,感染后,0⁸h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,128h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,12⁶0h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后060h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后0¹2h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;1212h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;12⁶0h为突破期,病毒DNA含量呈对数增长;感染60h后增长速度减缓,病毒含量维持在较高水平逐步进入稳定期,病毒DNA含量呈"S型"曲线增长。     

猪细小病毒的PCR检测、分离及鉴定

根据GenBank中报道的猪细小病毒基因组序列,利用PCR引物设计软件,设计并合成了1对引物,通过对PCR反应条件的优化,成功地扩增出了511bp的目的片段,建立了PCR检测PPV的方法。利用该方法对120份临床样品进行检测,共检测到4份阳性样品,并成功地分离到2株PPV,1#病毒分离株理化特性鉴定表明其符合PPV的特性。     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10²拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检...     

二乙烯亚胺对猪细小病毒的灭活作用

使用新型灭活剂二乙烯亚胺(binary ethylenimine,BEI)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)进行了灭活试验,通过ST传代细胞接种法观察病毒灭活后是否出现细胞病变,并结合血凝试验检测灭活效果,确定最佳灭活方法。用3～5日龄乳鼠检测BEI灭活后的病毒培养物和相应制备疫苗的安全性,并用豚鼠检测该灭活工艺制备疫苗的效果,与传统甲醛灭活进行了比较。结果显示,终浓度为1‰的BEI在32℃情况下经20 h即可彻底灭活PPV病毒;BEI灭活的病毒制备的疫苗免疫豚鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体。     

猪细小病毒NS1基因密码子偏爱性分析

为给猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）主要非结构蛋白（NS1）基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对PPVNS1基因进行密码子偏爱性分析。结果显示PPVNS1基因的CAI值为0．642,ENC值为39．703,这表明NS1在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第三位核苷酸尤其偏爱A或T;从与PPVNS1基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有26个、人有27个;PPVNS1基因共有71个大肠杆菌稀有密码子,并且还有多个稀有密码子多次串联成簇出现的情况。结果表明酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。     

新型鹅细小病毒研究进展

鸭细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)或番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一种传染病。经典MDPV和GPV毒株引起的病鸭主要症状为腹泻、脚软、渗出性肠炎,三周龄内雏鸭感染发病率和死亡率都很高。但是2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地的雏半番鸭和樱桃谷鸭陆续出现一种新型细小病毒病,该病发病率10%~30%,病死率低于3%,临床症状主要为软脚、短嘴和生长障碍。通过对该病病原进行全基因组测序及系统发育树分析,结果发现该病原与鹅细小病毒亲缘性很近。本文通过比较新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)与经典的MDPV和GPV在基因组、感染宿主范围和致病性的区别,为新型鹅细小病毒病的防控提供理论依据。     

1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为研究山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行病毒株的遗传变异情况,本研究从山东省威海市某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的猪肺脏组织中分离到1株PRRSV,命名为SDwh,并对其进行了全基因组序列测定、遗传演化分析和重组分析.结果显示:该病毒株在Marc-145细胞上生长良好,可见明显细胞病变;全基因组演化分析和同源性比对分析结果显示,SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like位于同一分支;与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%;与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%;与北美经典病毒株VR2332、中国HP-PRRSV JXA1和HuN4的同源性均为85.3%;与欧洲型病毒株Lelystad-virus(LV)同源性最低,为60.6%.与VR2332相比,Nsp2氨基酸序列比对结果显示,SDwh株存在NADC30-like病毒株典型的131个不连续氨基酸的缺失,同时在584~585位缺失2个氨基酸;GP5氨基酸序列比对结果显示,SDwh在GP5抗原表位上有氨基酸的突变.全基因组重组分析结果显示,SDwh株是一株重组病毒株,为NADC30与JXA1-P80的重组病毒,潜在的重组位点位于Nsp2中(2066 nt).本研究结果为PRRSV流行株的重组、演化分析和防控提供借鉴意义.     

猪细小病毒分离,核酸探针研制及应用

采用分子克隆技术制备了ＰＰＶ－ＤＮＡ－Ｃ片段（ＰＰＶ－ＲＦ－ＤＮＡ,经Ｐｓｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ⅲ的双酶切片段,称为Ｃ片段）及含Ｃ片段的ＰＵＣ１９重组质粒（ＰＵＰ）,利用地高辛标记,分别制备探针２和探针１。对猪细小病毒ＤＮＡ进行斑点杂交,两种探针均为阳性,而对照的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒及ＰＫ－１５细胞的核酸均为阴性。并且后一种探针的敏感性高于前者,两种探针的ＤＮＡ检出限量分别为４０ｐｇ和     

犬细小病毒实时荧光RPA检测方法的建立

由犬细小病毒(CPV)引起的犬细小病毒病是我国出入境口岸宠物检疫的重要疫病。为了提高检疫效率,本研究拟建立检测CPV的实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)方法并进行评价。本研究根据CPV衣壳蛋白基因序列设计RPA引物,以GB/T 27533-2011中的PCR方法作为参照,通过检测其他4种犬病毒和3种其他种属的细小病毒来分析实时荧光RPA的特异性、检测不同浓度的模板分析实时荧光RPA的灵敏度、检测CPV阳性或阴性犬的不同组织、血液、尿、粪便等样本以及7株CPV野毒株来分析实时荧光RPA的稳定性。结果显示,本研究建立的实时荧光RPA特异性好、灵敏度高,检测临床组织、体液、粪便样本以及野毒株时都具有良好的稳定性。结果表明,本研究建立的实时荧光RPA可满足CPV快速检测要求。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

猪博卡病毒是最新发现的一种DNA病毒,于2009年首次在瑞典患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪体内被鉴定。为了及时地评估其在我国的流行情况,本研究根据GenBank上递交的唯一一条猪博卡病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,并首次建立了猪博卡病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好,对2009年我国部分省市猪场的191份临床样品进行检测,结果75份为猪博卡病毒阳性,这表明我国猪群中猪博卡病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以作为猪博卡病毒在临床上的一种诊断技术。     

猪细小病毒N株的生物学和免疫学特性研究

猪细小病毒N株是从广西初产母猪所产死胎脏器分离的自然弱毒株。用这个毒株接种PPV HI抗体阴性的四月龄小猪和怀孕14～23天的后备母猪进行安全性试验,结果无任何异常临床症状、病毒血症和同居感染,母猪分娩正常,初生仔猪在吃初乳前HI抗体阴性。该毒株免疫的小猪、后备母猪和怀孕母猪,完全能抵抗猪细小病毒强毒攻击,攻毒后49天剖杀母猪,结果胎儿正常,胎儿心血HI抗体阴性,取胎儿脏器未分离出病毒,分娩母猪产仔正常,仔猪吃初乳前HI抗体阴性。而对照猪攻毒后产生病毒血症,产下不同组合异常仔,并从死胎儿脏器分离出病毒,健活仔猪吃初乳前能测出HI抗体。从而证明用N株作为弱毒苗能防止由猪细小病毒引起的繁殖障碍性疾病。     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

2011~2013年间,从山东省、河北省和江苏省等地的多个貂场疑似水貂出血性肺炎病貂的肺脏、肝脏和脾脏中分离到425株疑似绿脓杆菌。用绿脓杆菌的OprF和PEA基因的PCR引物对分离菌株的目的基因扩增,经核苷酸测序确定其均为绿脓杆菌序列。通过日本生研株式会社血清学分型系统进行分型：G型376株,占88.5%;B型34株,占8%;C型12株,占2.8%;E型3株,占0.7%。取其中6株细菌（G血清型3株,其他血清型各1株）进行详细生化试验,结果显示该6株菌均符合绿脓杆菌的生化特性,并且从这6株中选4株细菌（每血清型各1株）腹腔接种小白鼠和气管内接种水貂,结果表明4株菌对其均有致病性。