对甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株筛选

依据对夜蛾科具有高毒力cry基因的序列,设计特异性引物对实验室保存的对鳞翅目害虫高效的菌株资源进行筛选。通过比较质粒图谱,对其多样性进行了研究。进一步测定Bt菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株。从192株菌株中筛选出15株对夜蛾科害虫具有高活性的菌株,包含的基因类型有:cry1A、cry1C、cry2A、cry9和vip3A类基因,晶体形态包含:双锥体形、方形、球形;其中2株菌表达130ku和60ku的蛋白,1株菌表达130ku和70ku的蛋白,其余菌株均表达约130ku的蛋白;这15株菌通过质粒图谱分析分为8种类型;3株菌对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力,其中菌株PS3-C2对甜菜夜蛾LC50为1.87μg/mL。本研究成功筛选出对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株3株,其中PS3-C2菌株与对照菌株KN11活性相当,为新型杀虫基因分离克隆与制剂的研发奠定了基础。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫，给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害。为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控，亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源。本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株，基于菌株杀虫基因差异及进化关系，去除冗余菌株后获得172株候选菌株。通过培养获取这些菌株胞晶混合物，进行杀虫蛋白定量后，测定杀虫活性，获得27株对草地贪夜蛾初孵幼虫具有较高杀虫活性的菌株，其中菌株B14-D2的杀虫活性最高，LC₅₀为0.155 μg/g。克隆了该菌株中的cry1Ea3基因并在HD73^-无晶体突变株中表达，Cry1Ea3蛋白对草地贪夜蛾初孵幼虫LC₅₀为1.789 μg/g。本研究为新的Bt产品和杀虫基因的开发利用提供了丰富资源。     

三株球孢白僵菌对草地贪夜蛾的毒力比较

为筛选有效防治草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的微生物制剂,采用室内生物测定法测定从北京市、浙江省和海南省土壤样品中分离获得的3株球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株bbbj、bbzj和bbhn对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力,并比较这3株菌株的产孢情况和合成白僵菌素的能力。结果显示,分离自北京市的菌株bbbj对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力最强,LC50为3.37×105个孢子/mL;其次为浙江省的菌株bbzj,毒力略逊于菌株bbbj;海南省的菌株bbhn毒力最弱,其在试验最高浓度108个孢子/mL处理7 d后对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率低于50%。菌株bbbj的产孢量远高于另外2株菌株,并且其菌丝结构上着生大量芽生孢子簇,而且菌株bbbj菌体中的白僵菌素含量最高,培养5 d后,分别为菌株bbzj和bbhn的40.08倍和65.85倍。虽然补充白僵菌素可以提高菌株bbhn的毒力,但是草地贪夜蛾幼虫对白僵菌素敏感度不高。表明球孢白僵菌菌株bbbj对草地贪夜蛾幼虫有较高的毒杀活性,具有作为草地贪夜蛾生防菌株的潜力。     

多杀霉素对草地贪夜蛾幼虫的室内毒力及田间防控效果

为明确多杀霉素对草地贪夜蛾的作用效果,开展了室内毒力测定和田间药效评价,为多杀霉素用于草地贪夜蛾防治提供参考依据。室内毒力测定结果表明,多杀霉素对草地贪夜蛾有较高的毒性,对低龄幼虫的毒力高于高龄幼虫,2～5龄草地贪夜蛾LD50分别为0.87、3.76、5.54、10.28 mg/L,加入20%多杀霉素增效剂未表现出对3龄幼虫的增效作用。田间试验结果表明,多杀霉素对草地贪夜蛾防效良好,20%多杀霉素悬浮剂5 000倍液、8 000倍液、12 000倍液药后10 d的防效分别为91.98%、67.33%、54.43%。基于经济阈值的害虫防治简易判别规则分析经济效益表明,防治玉米苗期的草地贪夜蛾,以20%多杀霉素悬浮剂5 000倍液为最佳选择。     

8种杀虫剂对草地贪夜蛾幼虫的室内杀虫活性及毒力测定

为筛选农业生产中防治草地贪夜蛾幼虫效果较好的杀虫剂,以草地贪夜蛾初孵幼虫和3龄幼虫作为试材,采用浸叶法,研究了8种杀虫剂对草地贪夜蛾幼虫的室内杀虫活性和毒力测定。结果表明：8种杀虫剂对草地贪夜蛾初孵幼虫在田间推荐最低剂量下药后72 h、对3龄幼虫在田间推荐最高剂量下药后96 h的校正死亡率均为100%,都具有很好的杀虫活性;在室内毒力测定中,10%多杀霉素甲维盐WG和5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG对草地贪夜蛾初孵幼虫药后24 h和48 h的LC₅₀值分别为0.010 8 mg/L和0.010 9 mg/L,以及0.009 1 mg/L和0.007 7 mg/L,相对毒力较高;5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG对3龄幼虫药后24 h和48 h的LC₅₀值分别为0.024 6 mg/L和0.017 9 mg/L,相对毒力最高;8种杀虫剂对草地贪夜蛾初孵幼虫和3龄幼虫均表现为同一杀虫剂对初孵幼虫的LC₅₀值小于处理相同时间下对3龄幼虫的LC₅₀值,且同一杀虫剂处理48 h的LC₅₀值小于...     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）是一种迁飞性重大害虫。为了弄清不同微生物联合使用对草地贪夜蛾的生防潜力,在室内条件下采用直接喷雾方法,测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421、球孢白僵菌Beauveria bassiana ZJU435和苏云金芽胞杆菌（Baci1lus thuringiensis,Bt）G033A两两之间对草地贪夜蛾幼虫的室内联合杀虫活性。结果表明：金龟子绿僵菌CQMa421与球孢白僵菌ZJU435悬浮液联合接种10 d后,1～3龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率分别为65.6%、58.8%和35.4%,都显著高于CQMa421和ZJU435单剂处理组。CQMa421与Bt联合接种5 d后,2龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为82.6%,显著高于CQMa421（21.1%）和Bt（65.5%）单剂处理;ZJU435与Bt联合接种5 d后,2龄和4龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为80.4%和68.6%,显著高于Bt和ZJU435单剂处理组。上述试验结果表明：不同杀虫真菌联合使用、杀虫真菌与Bt联合使用能有效提高对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性,为田间利用不同微生物农药有效防控草地贪夜蛾提供了依据。     

11种植物源杀虫活性成分对草地贪夜蛾的毒力测定

草地贪夜蛾是2018年入侵我国的重大迁飞性害虫, 对玉米等农作物生产构成重大威胁。为开发新型生物农药产品,提供防效更高的生物农药品种, 本研究采用点滴法评价了蛇床子素、大蒜素、补骨脂素、闹羊花毒素Ⅲ、印楝素、对叶百部碱、莨菪碱、血根碱、辣椒碱、苦参碱和丁香酚等共11种植物源杀虫活性成分对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力水平。结果显示:这11种杀虫活性成分对草地贪夜蛾2龄幼虫均有毒杀作用, 但起效时间都有不同程度的滞后。用药后48、72 h和168 h, 不同杀虫活性成分对草地贪夜蛾2龄幼虫的LD50范围分别为0.212～14.382 μg/头、0.191～11.675 μg/头和0.164～9.463 μg/头。药后72 h 毒力大小顺序为:丁香酚＞印楝素＞闹羊花毒素Ⅲ＞补骨脂素＞血根碱＞大蒜素＞苦参碱＞莨菪碱＞蛇床子素＞辣椒碱＞对叶百部碱。研究结果为利用丁香酚等活性成分开发防治草地贪夜蛾的生物农药新产品提供了技术支撑。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

一株罹病草地贪夜蛾成虫莱氏绿僵菌的分离鉴定及其致病力

从草地贪夜蛾成虫尸体中分离获得一株杀虫真菌。经形态和分子鉴定,确定该虫生真菌为莱氏绿僵菌,并命名为Nr Sfadult202104。生物学特性的研究结果显示,该菌株在SMAY+0.5%草地贪夜蛾蛹粉培养基上生长速率和分生孢子产量最佳;在28℃时菌落生长速率最快,20℃时产孢最为适宜;在全光照条件下该菌株产孢量最高。对草地贪夜蛾成虫和3龄幼虫的致病力测定结果显示,该菌株对草地贪夜蛾雌、雄成虫以及3龄幼虫都具有一定的毒力效果。当孢子浓度为1.0×10⁸孢子/m L时,其感染雌、雄成虫校正死亡率分别为61.2%和58.1%;菌株接种3龄幼虫后,随孢子悬浮液浓度的升高,幼虫的感病死亡率也随之增加,当浓度达到1.0×10⁸孢子/m L时,3龄幼虫的致死中时(LT₅₀)为5.30 d,接种8 d后3龄幼虫的校正死亡率为66.12%。综合以上结果,莱氏绿僵菌Nr Sfadult202104菌株对草地贪夜蛾具有潜在的生防作用,值得深入研究。     

一株莱氏绿僵菌的筛选及其对草地贪夜蛾的毒力

开展草地贪夜蛾病原真菌的筛选和毒力测定可为草地贪夜蛾的绿色防控提供新的生物制剂。本研究从广西南宁田间采集的草地贪夜蛾幼虫僵虫上分离获得一株病原真菌,采用形态学和ITS-rDNA序列分析相结合的方法对该菌株进行了鉴定,并采用浸虫法测定了该菌株对草地贪夜蛾的致病力。结果表明新分离的菌株为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,编号为CDTLJ1;该菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹均有致病力,1.20×10⁷孢子/mL浓度下,接菌处理后第6 d,2~5龄幼虫的累积校正死亡率均达100%,6龄幼虫的累积校正死亡率为98.33%,预蛹和蛹的累积校正死亡率分别为28.33%、20.00%,草地贪夜蛾2~6龄幼虫的LT50值从3.91 d升至4.24 d;菌株CDTLJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率随孢子悬浮液浓度的升高而增加,当浓度达1×10⁸孢子/mL时,幼虫的致死LT50为4.10 d,接菌处理后第6 d,3龄幼虫的累积校正死亡率达100%,LC₅₀为1.12×10⁴孢子/mL。结果表明,莱氏绿僵菌CDTLJ1对草地贪夜蛾有良好的生防潜力,具有进一步深入研究和开发利用的前景。     

苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11蛋白C端点突变对其杀虫活性的影响

为研究Vip3Aa11羧基端对其杀虫活性和敏感性的影响,本研究利用定点突变技术构建了Vip3Aa11的3个突变体S543N、D547E和T681V。经SDS-PAGE分析证实3个突变体蛋白均能在大肠杆菌中表达分子量约88 kD的目的蛋白,生物活性测定显示,与Vip3Aa11相比,突变体S543N对甜菜夜蛾Helicoverpa armigera的杀虫活性提高了5倍。突变体D547E对甜菜夜蛾杀虫活性显著降低。突变体S543N、D547E和T681V对棉铃虫Spodoptera exigua的杀虫活性无明显变化。说明Vip3Aa11 C端部分氨基酸的定点突变对其杀虫活性有影响,且对不同害虫的杀虫活性变化趋势不同。本研究比较了Vip3Aa11蛋白与突变蛋白之间杀虫活性的差异,为研究Vip3Aa类蛋白的结构和机理奠定基础。     

杀虫真菌对草地贪夜蛾不同虫态的室内活性

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）是一种联合国粮农组织预警的全球重大害虫。为了评价杀虫真菌对草地贪夜蛾的生防潜力,在室内条件下测定了杀虫真菌金龟子绿僵菌CQMa421、球孢白僵菌ZJU435对草地贪夜蛾不同龄期幼虫、蛹、成虫和卵的杀虫活性以及对卵孵化率、蛹羽化率等影响。结果显示：26℃条件下,菌株CQMa421和ZJU435对草地贪夜蛾低龄幼虫具有杀虫活性,接种10 d后对1龄幼虫的校正死亡率分别为35.6%和50.5%,但随虫龄增大杀虫活性降低,其中菌株CQMa421对4龄幼虫几乎没有杀虫活性;菌株CQMa421和ZJU435都引起草地贪夜蛾蛹黑化,降低其羽化率50%以上;但对成虫没有杀虫活性,也不影响成虫的产卵;卵接种菌株CQMa421和ZJU435后,孵化率分别为82.8%和90.7%,显著低于空白对照的100%,并极大地降低新孵化幼虫的存活率,分别为20.8%和0.0%,而空白对照为79.4%。结果表明,杀虫真菌CQMa421和ZJU435对草地贪夜蛾低龄幼虫、蛹和卵具有杀虫活性,同时降低卵的孵化率、新孵化幼虫存活率和蛹羽化率,对草地贪夜蛾种群控制极具潜力。     

小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展的研究

使用苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（Btk）可湿性粉剂对小菜蛾进行继代汰选获得F₈₀代和F₁₀₀代抗性品系。通过分别测定Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca四种杀虫晶体蛋白对小菜蛾Btk抗性品系F₈₀代和F₁₀₀代的室内毒力,明确了小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展规律。研究结果表明,汰选至F₈₀代时,Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀约12.1 mg/L,其次为Cry1Ac,LC₅₀约47.7 mg/L;而汰选至F₁₀₀代时,仍以Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀约21.4 mg/L,其次为Cry1Ab,LC₅₀约72.2 mg/L。与相对敏感品系相比,小菜蛾抗性品系对Cry1Ac的抗性发展较快（抗性倍数高达67.3～106.8倍）,对Cry1Ab的次之（抗性倍数高达60.0～66.1倍）,而对Cry1Ca和Cry1Ah的抗性发展较慢（抗性倍数分别为3.4～6.0倍和1.6～2.5倍）。以上结果说明,在主效杀虫基因为Cry1Ac的Btk药剂选择压力下,小菜蛾对四种Bt杀虫晶体蛋白的抗性发展速度差异较大,且Cry1Ac和Cry1Ab存在交互抗性风险。     

球孢白僵菌对葱地种蝇成虫的毒力及繁殖力的影响

本文采用浸虫法测定了4株球孢白僵菌对1日龄葱地种蝇（本文称葱蝇）成虫的毒力,筛选出高致病力的菌株,描述了感染症状,测定了其亚致死剂量LC₂₀和LC₅₀对存活1日龄葱蝇成虫生物学参数和繁殖力的影响,并比较了5.8×10³和5.7×10⁵孢子/mL对1日龄和10日龄葱蝇成虫死亡率和单雌产卵量的差异。结果表明菌株Bb01对葱蝇成虫的致病力最强,其LC₅₀为1.76×10⁶孢子/mL,其次为菌株Bb03和Bb02,其LC₅₀分别为4.05×10⁶和1.86×10⁷孢子/mL。与对照相比,菌株Bb01亚致死剂量处理1日龄成虫后,明显延迟了葱蝇成虫的产卵前期,降低了单雌产卵量,LC₂₀浓度处理时单雌产卵量比对照下降了51.9%,LC₅₀处理下降92.2%,明显缩短了雌成虫寿命,但卵孵化率没有明显影响。虽然菌株Bb01对1日龄成虫造成的死亡率较高,但在5.7×10⁵孢子/mL下,10日龄成虫单雌产卵量比对照下降了82.5%,对种群控制效果仍较强。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC₅₀为13.1 μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。     

对暗黑鳃金龟成虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选

暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC₅₀为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC₅₀为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。     

高毒力白僵菌的筛选及对花生甜菜夜蛾的致病力

为了筛选高毒力的生防白僵菌菌株,本研究对分离获得的4株白僵菌F1、F5、F6、F8的生物学特性进行分析,并在室内检测对甜菜夜蛾的致病力,最后通过大田试验验证了高毒力菌株对花生甜菜夜蛾的防治效果。结果表明,上述4株白僵菌的菌落形态、生长速率、产孢量等生物学性状及致病力存在显著差异。生长最快以及产孢量最高的是菌株F1,菌落呈粉状。菌株F6的分生孢子较其他菌株的分生孢子大。致病力检测结果表明,菌株F1对甜菜夜蛾的致病力最强,LC₅₀和LT₅₀分别是2.9383×10⁶ cfu/mL和5.79 d;其次是菌株F8,菌株F5和F6的毒力相对较弱。大田防效试验表明,菌株F1对花生甜菜夜蛾的防治效果可达75%以上,并在花生叶片具有较强的定殖能力。