枯草芽胞杆菌GB519在水稻植株中的定殖及对稻瘟病田间防效

枯草芽胞杆菌GB519是一株具有广谱抑菌活性的生防菌株。本研究利用绿色荧光蛋白标记的菌株GB519-GFP处理水稻种子、根和叶片,结合激光共聚焦显微镜观察和抗生素平板回收检测的方法,探究其在水稻根茎叶中的定殖动态。结果显示：经GB519-GFP发酵液处理水稻种子、根和叶片后,菌株均可内生定殖于植株的表皮、皮层和维管束中,表明其可在水稻植株内迁移和定殖。GB519-GFP在处理部位的定殖量通常呈现先减少后增多的趋势,非处理部位3～5 d后即可检测到标记菌株。浸种处理,3 d后在幼芽中可检测到标记菌株;20 d后在根中的菌量最多,达5.7×10⁵ cfu/g。灌根处理,1 d后根中菌量为5.4×10⁵ cfu/g; 20 d后根、茎和叶中菌量均达到最大值;处理80 d后,根中定殖数量仍达1.9×10⁵ cfu/g。叶面喷施处理,1 d后叶片菌量为4.2×10⁵ cfu/g; 20 d后叶片菌量达4.4×10⁵ cfu/g。不同处理方法在各部位的定殖量几乎均在处理20 d后达到峰值。...     

植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态及对辣椒疫病的防治效果

为了探讨具生防作用的植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态与其防治辣椒疫病的关系,采用对峙培养法和盆栽苗防效法筛选生防菌株,依据菌体形态、生理生化性质和16SrDNA序列鉴定菌种,用抗利福平标记研究菌株在辣椒苗中的定殖动态,在同时接入植物内生细菌和灌根接种辣椒疫霉菌的条件下分析生防菌株的定殖数量与防效的关系。结果表明,菌株G9、R15和J13对辣椒疫病防效最好,经鉴定均为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。菌株G9和R15在辣椒根部定殖量高于菌株J13;定殖周期均在30-40d,呈“先增后减”的变化趋势;菌株G9和R15在接种第15d时定殖量最高,菌株J13在根、茎和叶中定殖量达到最高的天数分别为第9、15和15-20d,定殖数量的变化为根〉茎〉叶。菌株G9定殖量达到9．73×10^5cfu·g-1时辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约6d;菌株R15定殖量达到6．30×10^5cfu·g-1以上时对辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约14d。研究结果展现了植物内生细菌在辣椒疫病生物防治上的应用潜力,为制定植物内生细菌防治辣椒疫病的施用技术提供了科学依据。     

海洋细菌解淀粉芽胞杆菌BA-3在兰花的定殖及对根际微生态的影响

为明确海洋细菌解淀粉芽胞杆菌BA-3在兰花根际的定殖特性,本研究采用抗生素标记法筛选出对利福平和卡那霉素稳定的菌株BA-3-K。平板对峙试验证明,菌株BA-3-K对兰花茎腐病抑菌率达86.91%,与原始菌株BA-3抑菌率87.69%无明显差异。采用灌根法和涂茎法证实了标记菌株BA-3-K能在兰花植株体内定殖达60 d以上。灌根处理表明,生防菌BA-3-K的定殖数量为土壤>根>茎,呈先升后降的趋势,第21d在根部和茎部达到最大分别为2.54×10^5和1.47×10^5cfu/g,在土壤中第15d达到最大6.50×10^5cfu/g,但叶部未检测到标记菌株BA-3-K;涂茎处理生防菌的定殖量茎>叶,第17 d在茎部达到最大2.33×10^5cfu/g,随后呈下降趋势,根部和土壤未检测到标记菌株BA-3-K;通过扫描电镜定性观察,发现BA-3-K可在植株茎部定殖。盆栽试验表明,菌株BA-3-K施用后,根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量明显高于对照处理。本研究表明海洋细菌BA-3有较强的定殖能力,具有良好的应用价值。     

内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果

采用抗利福平标记菌株的平板菌落计数法,检测了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦根部的定殖能力及消长动态,发现菌株CC09在小麦根内、根表和根际均能定殖,接种后5 d定殖量分别稳定维持在2.7×105、2.0×105和5.5×105 cfu/g。透射电镜观察发现,菌株CC09能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖,且不影响根组织细胞结构。室内盆栽试验表明,用菌株CC09发酵液灌根处理小麦,对由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum侵染引起的麦苗赤霉病的防效高达90.7%,表明菌株CC09是潜在的防治小麦赤霉病的生防菌,具有良好的开发和应用价值。     

解淀粉芽孢杆菌B6在番茄根部定殖及对番茄枯萎病盆栽防效初步研究

采用利福平选择标记解淀粉芽孢杆菌B6,于土培及水培条件下研究其在番茄根部定殖情况及对番茄枯萎病的防治效果。结果表明,番茄种子出芽后4～19 d,根表及根际均能成功检测标记菌株B6~R。在根表,标记菌株B6~R定殖密度4 d时达最高,后逐渐下降,16～19 d稳定在7.40×10~5 cfu/g。在根际,标记菌株B6~R定殖密度先升高后降低,菌体数量稳定在2.53×10~6 cfu/g。水培条件下,能够观察到标记菌株B6~R在番茄根部附着定殖。室内盆栽试验显示,解淀粉芽孢杆菌B6能够较好防治尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病,防治效果达64.35%。     

长枝木霉菌T115D诱导大豆叶片防御酶活性及疫病盆栽防治效果

采用分光光度和盆栽方法,分别测定长枝木霉菌T115D对大豆叶片防御酶活性的影响及大豆疫病的防治效果。结果表明,菌株T115D发酵液的不同处理均可诱导大豆叶片PAL、POD、PPO、SOD和CAT的活性增强,并且比单独接种疫霉菌处理的酶活持续时间长、峰值高;提前接种木霉有孢子发酵液后,第2 d再挑战接种大豆疫霉菌的处理诱导效果最好,PAL、POD、PPO和CAT 4种酶的活性在处理后第5 d达到最大值,分别是Petri培养液对照处理的2.5、6.6、4.8和3.5倍。菌株T115D发酵液不同处理均可降低大豆疫病的发生。发酵液喷雾处理中,提前1 d接有孢子发酵液,第2 d接大豆疫霉菌处理的防效最好,其防效为73.3%,显著高于其他处理;发酵液灌根处理中发酵液和疫霉菌同时灌根处理的防效最好,其防效为51.8%,显著高于其他处理。菌株T115D发酵液不同接种量对大豆疫病的防治效果,以接有孢子的发酵液15 mL最高,防效为达70.9%。     

内生细菌EBS05在小麦体内的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治作用

以抗药性突变菌株为筛选标记,采用稀释倒平板法,研究了内生细菌EBS05在小麦体内的定殖动态,并通过盆栽和大田试验研究了EBS05对小麦纹枯病的防治效果。结果表明,EBS05在小麦根内具有较强的定殖能力,且能从根部向茎、叶部转移,其定殖量与菌株的接种浓度呈正相关,当接种浓度为108 CFU/mL时,EBS05能在根、茎内有效定殖,并持续向叶内转移。以菌体浓度为108CFU/mL的发酵液进行浸种或灌根处理后,EBS05在根内定殖量始终大于同时期茎、叶内的定殖量;菌株在小麦根、茎和叶内的定殖数量均表现为接种初期逐渐增加,至接种后第10～12天达到最大值,随后逐渐降低。内生细菌EBS05对小麦纹枯病的防治效果优于对照药剂25 g/L咯菌腈（flu-dioxonil）悬浮种衣剂,带菌发酵液和除菌发酵液的盆栽防治效果分别达91.2%和88.2%,大田防治效果分别为66.3%和56.2%。     

内生解淀粉芽孢杆菌CC09菌株在小麦叶部的定殖能力及其防治白粉病效果研究

利用抗利福平标记及平板菌落计数法,研究了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦叶内和叶际的定殖能力,证明菌株CC09能够在小麦叶内和叶际以较高数量稳定定殖,叶际定殖量在喷雾后1 d达到最大(3.98×107 cfu/g),之后稳定维持在1.58×104~3.16×105 cfu/g;而叶内的定殖量7 d时达到最大(1.58×106 cfu/g)并维持稳定。另外,菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖受温度及其代谢产物的影响,温度越高,其叶际和叶内定殖量越高;菌体重悬液中添加相当于原发酵液中代谢产物含量1倍和4倍的浸膏能显著提高菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖;而接种量对菌株CC09的定殖无显著影响。琼脂培养法测定表明,菌株CC09发酵液及其无菌滤液对小麦白粉菌分生孢子萌发均有显著的抑制作用,导致孢子透明、变形甚至细胞破裂。室内盆栽试验表明,菌株CC09发酵液对小麦白粉病有很高的预防和治疗效果,15 d时防效为95%,是三唑酮的2.3倍,而其20倍稀释液的防效与化学农药三唑酮效果相当。以上研究结果表明菌株CC09是防治小麦白粉病的潜在生防菌株,具有良好的开发和应用价值。     

生防菌株SW11在番茄植株上的定殖能力及其对番茄灰霉病的防控效果

通过抗生素抗性标记法结合室内拮抗和小区防效试验,研究生防菌株SW11在番茄植株及其根围土壤中的定殖能力,及其对番茄灰霉病的防控效果.结果显示菌株SW11在番茄根、茎、叶和根围土壤中均能够较长时间定殖寄生,施药后5d在番茄植株内定殖量达到最高值,在根围土壤和植株表面则呈先多后少、逐渐下降的动态变化趋势,施药30 d后,菌株SW11抗Rif标记菌株在根面的存在量为1.31×104 cfu/g,根围土壤中为4.88×102 cfu/g,叶面为1.84×102 cfu/g,茎外为0.87×102 cfu/g,根、茎和叶内为20～65 cfu/g.当菌液浓度为1.57×108 cfu/mL时,施药7d后对番茄灰霉病的预防效果可达88.15％,治疗效果可达70.50％.研究结果证明生防菌株SW11可以成为番茄植株微生态环境中的有益微生物之一,能够有效控制番茄灰霉病的发生和为害,为其开发应用和番茄灰霉病的生物防治提供了理论依据和有效途径.     

抗香蕉枯萎病菌拮抗菌的鉴定及其定殖

通过逐步提高药物浓度方法,获得了抗利福平400μg/ml、对香蕉枯萎病菌拮抗活性稳定的T2WF和W10标记菌株。初步确定两菌株为芽孢杆菌属细菌。采用灌根接种法,在香蕉苗根际土和香蕉苗体内定殖结果表明,拮抗菌液接种浓度为5×104cfu/ml,两菌株均可从香蕉根际土和香蕉体内分离到,并在香蕉体内定殖和传导。在香蕉根际土、根部、球茎和假茎中,T2WF标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、5、11和3d,分别为707、437、273、117cfu/mg;而W10标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、3、5和5d,分别为784、260、253、110cfu/mg。两菌株在香蕉根际土和香蕉体内1~15d的消长动态均有一个共同的“由升到降”趋势。从数量和数量变动幅度上看,香蕉根部的菌量明显高于茎部的菌量。     

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。     

大豆疫霉MAPK基因的鉴定与转录分析

 疫霉菌包括大豆疫霉等重要植物病原物,属于茸鞭生物界卵菌门,在进化上与真菌相差甚远;由于分离培养与遗传转化等相对困难,目前对其生长发育和致病机理的研究相对滞后。本研究综合运用基因组学和转录组学方法,首先对植物病原卵菌与真菌的蛋白激酶特别是MAPK进行了鉴定和比较,然后对大豆疫霉MAPK的基因结构、蛋白功能域以及转录模式等进行深入分析。结果表明,植物病原卵菌比真菌含有更多的蛋白激酶(包括MAPK),且卵菌及其近缘物种硅藻的MAPK与真菌在进化上相对独立;大豆疫霉的14个MAPK中,4个具有非典型的磷酸化唇序列,7个含有PH、C2、WW、PAS等与细胞信号转导相关的其它功能域;转录分析表明,大部分MAPK可能在大豆疫霉生长发育与致病的整个过程或特定过程中发挥重要作用。本文通过对蛋白激酶特别是MAPK的分析揭示了植物病原卵菌(与真菌相比)在细胞信号转导网络与机制上的独特性与复杂性,可为进一步研究疫霉菌MAPK的生物学功能及其信号调控机制提供参考。     

蒙城大豆疫霉菌的鉴定及其生理小种

 在安徽省蒙城县对大豆疫霉根腐病的发生情况进行调查。应用选择性培养基对类似大豆疫霉根腐病症状的病株进行病原菌分离,在春大豆蒙城早熟青豆病株上分离到2株疫霉菌PMC1、PMC2和一些Fusarium spp.,在夏大豆上分离到的主要病原菌为Pythium spp.和Fusarium spp.,未分离到疫霉菌。根据疫霉菌分离物PMC1和PMC2形态和生理学特征以及对大豆的专化致病性,2个分离物被鉴定为大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)。应用国际通用鉴别寄主进行生理小种鉴定,PMC1和PMC2的毒力公式分别为1b,1d,3a,3c,5,7和1b,1d,4,5,为新的小种类型,定名为中国6号小种、中国7号小种(CNR-6和CNR-7)。这是首次报道大豆疫霉菌在我国淮北地区存在。     

大豆和大豆疫霉菌共培养体系的构建

 本研究旨在建立一个适于分析大豆遭受大豆疫霉菌侵染后基因表达研究的互作体系。在比较了15个携带不同抗病基因的大豆基因型的组织培养情况和7个大豆疫霉菌分离物及其游动孢子单孢系的毒力变化的基础上,构建了大豆悬浮细胞和大豆疫霉菌游动孢子的共培养体系,进而分析了共培养过程中大豆细胞的活力和防御基因表达情况。结果表明,不同亲和力菌株的游动孢子引起的大豆细胞活力变化十分相似;非亲和菌株的游动孢子可诱导寄主防御基因的表达发生变化。此系统为深入开展大豆抗性机制研究提供了良好的平台。     

大豆疫霉根腐病

 大豆疫霉根腐病是毁灭性病害之一,在我国近年有加重发展趋势。美国、澳大利亚和加拿大对Phytophthora sojae及大豆抗性研究较多,目前已建立了完善的生理小种体系,分离了30多个生理小种,最新定名小种为38和39号。RFLP研究表明,P.sojae的多数变异都可在小种1,7,17和19号中表现出来,因而推测其它小种可能是从这4个小种杂交派生而来,澳大利亚的P.sojae由美国传入。抗、耐病筛选方法有田间筛选法、接种体薄层法、斜板法、下胚轴接种法和豆荚接种法等。选出不少抗病材料,通过遗传研究定名了抗性基因Rps1、Rps-b、Rps-c、Rps1-d、Rps1-k、Rps2、Rps3、Rps3-b、Rps3-c、Rps4、Rps5、Rps6和Rps7等。Rps1-k是目前应用较广的抗性基因,它能抗20多个生理小种。抗性基因Rps1和Rps1-c从被利用到丧失抗性大约是8~10年的时间,按此推算几年之内Rps1-k基因也将丧失抗性,因此主张抗病基因和耐病基因结合使用,不同抗性基因结合使用。     

大豆疫霉RNA结合蛋白PsM90的基因功能研究

 真核生物的基因表达能够在转录与转录后等水平受到调控,以适应不同时空环境中的生长与发育等生物学过程,其中PUF家族RNA结合蛋白是一类具有保守PUM-HD(Pumilio homology domain)功能域的转录后调节因子,通过与靶标mRNA特异性结合控制其稳定性及翻译。本研究利用CRISPR/CAS9介导的疫霉菌基因组编辑技术,对大豆疫霉的PUF家族基因PsM90进行敲除和功能研究。结果表明,PsM90敲除突变体的卵孢子产量减少至野生型的32%,卵孢子壁明显变薄,卵孢子中的细胞器未能正常分化;游动孢子对大豆黄化苗下胚轴的致病力有所下降。此外,PsM90的敲除不影响营养菌丝生长、孢子囊发育、游动孢子释放和休止孢萌发等生物学性状。上述结果揭示了PsM90是大豆疫霉有性发育等过程的重要相关基因,为深入揭示卵菌中卵孢子发育这一独特生物学过程的分子调控机制奠定了基础。     

球孢白僵菌在玉米苗期的定殖及其对玉米生理生化特性的影响

为明确球孢白僵菌D1-5在玉米苗期的定殖规律及其对玉米生长状态和生理生化特性的影响,采用盆栽控制试验,研究了两种浸种时间（12和24 h）对菌株D1-5在玉米苗期不同部位（根、茎、叶）的定殖偏好性的影响,同时研究了几种生长指标对不同浸种时间的响应,分析了抗性相关防御酶活性（出苗14 d）变化情况。结果表明,叶片中菌株D1-5定殖检出率最高,达到40%,茎部其次,定殖检出率为10%,玉米根系未检测出菌株D1-5;各检测时期菌株D1-5处理组均高于对照组,差异显著,其中玉米出苗19 d生长势增长率最高,达到5.34%,出苗21 d叶面积增长率最高,达到13.71%,出苗28 d地上生物量增长率达到27.2%;菌株D1-5处理后叶片中抗性相关防御酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性均呈升高趋势,SOD活性增加最高,达到24.90%。菌株D1-5浸种对玉米苗期的生长发育有一定的促进作用,其中浸种12 h更有利于玉米幼苗生长,玉米相关防御酶的活性变化同球孢白僵菌-玉米之间的互作存在一定的相关性。     

华北棉铃疫病菌及蓖麻疫病菌的鉴定

 近年在华北地区普遍发生棉铃疫病和蓖麻叶果疫病。对于这两种疫病菌的形态和生理特性,按标准方法分剧进行了详细观察。把棉铃疫病菌鉴定为Phytophthora boehmeriae Sawada的一个株系,并对它的寄主范围作了补充,在温度关系和有性生殖习性上它不同于已往西印度报导的棉铃上的P.palmivora Bulter和P.parasitica Dastur。蓖麻疫病菌的性状与印度的典型P.parasitica Dastur相符合,与泽田兼吉在台湾描述的P.ricini Sawada和P.formosana Sawada两个新种只在寄主范围和孢子囊长宽比倒上稍有差异。