苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),属于蜡样芽胞杆菌族,芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌,与其它芽胞杆菌的区别是在形成芽胞的同时,伴随有杀虫晶体蛋白(Cry蛋白)的产生。Cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫作用,因此,Cry蛋白以微生物杀虫剂或转Bt基因植物的形式而被广泛应用于害虫生物防治中。本文从Bt菌株的发掘、cry基因的转录调控机制、Cry蛋白的结构功能及作用机制等方面进行综述,为Bt杀虫蛋白的推广应用、Bt蛋白的定向改造和构建高效广谱的工程菌提供参考。     

转录调控因子AbrB对生防短短芽胞杆菌X23中抗生素edeines生物合成的影响

非核糖体类抗生素edeines是短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis X23产生的主要抑菌物质,提高其产量有助于增加生防效果。通过全基因组测序及生物信息学分析挖掘短短芽胞杆菌X23的全局性调控因子,基于Red/ET同源重组技术构建温敏型敲除载体,通过双交换同源重组技术获得短短芽胞杆菌X23全局性转录负调控因子缺失的突变株,然后采用平板抑菌、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）和实时荧光定量PCR研究了全局性转录负调控因子敲除对短短芽胞杆菌X23不同生长时期发酵液的抑菌活性、edeines产量、ede操纵子转录水平的影响。从短短芽胞杆菌X23基因组中挖掘到了1个全局性转录负调控因子AbrB,敲除abrB基因后edeines生物合成基因簇操纵子的转录水平在生长前期显著提高,在发酵48 h后abrB突变株中edeine A和edeine B总产量比出发菌株提高了1.1倍。结果显示短短芽胞杆菌X23中AbrB是edeines生物合成过程中的负调控因子,敲除abrB提高了edeines的产量。     

苏云金芽胞杆菌安全性的研究进展

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最为广泛的一类微生物农药。本文分析比较了我国及美国Bt产品登记和安全评价等情况,并对Bt制剂的风险评价进行了分析。Bt菌株不是人或其他哺乳动物的已知病原体,对哺乳动物无毒性、感染性和致病性;其种群数量在环境中呈逐渐减少趋势,无残留风险;对非靶标昆虫的生存和繁殖及土壤微生物群落结构无显著影响。     

苏云金芽胞杆菌分离过程中无晶体芽胞杆菌的分析

本研究选择了在苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)分离过程中发现的与Bt芽胞相似、没有伴胞晶体的8株芽胞杆菌,对其种属、质粒等生物学特性和杀虫活性进行了初步研究.对分离菌株所产芽胞进行形态观察及质粒图谱分析,发现其与Bt相似;但肽指纹图谱分析和16S rDNA聚类研究表明所分离菌株与蜡样芽胞杆菌B.cereus(Bc)匹配最高;杀虫活性测定表明这8株菌对猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无毒杀作用,而15-3、W23-1和W25-3 3个菌株及其培养上清液对小菜蛾Plutella xylostella幼虫有一定的杀虫活性,说明它们能产生活性物质.这些结果说明在Bt菌株的分离过程中要对无晶体菌株加以重视,其含有的活性物质具有潜在的研究和利用价值.     

苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性

苏云金芽胞杆菌是生物防治中应用最为广泛的一种杀虫剂,它对多种昆虫和其他一些无脊椎动物具有特异的毒杀活性。苏云金芽胞杆菌的杀虫活性主要来自于菌体在形成芽胞期间生成的伴胞晶体毒素,这些晶体毒素在结构和生物学功能方面表现高度的多样性。本文介绍了苏云金芽胞杆菌晶体毒素的分类、命名方法,深入讨论了晶体毒素的氨基酸序列、三维结构、靶标生物和杀虫机理的多样性。评价了各种分类方法的特点,并展望了晶体毒素作用机制研究和未来晶体毒素新基因的发掘。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的调控

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能有效防治作物土传病害,前期研究证实,ywbB基因正调控NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力。本研究进一步分析了ywbB基因对NCD-2菌株的生长、菌落形态和芽胞产生等性状的影响。结果表明,同NCD-2野生型菌株相比,突变子ΔywbB降低了在LB和2×SG培养基中的生长速率;在LB或2×SG培养基上,NCD-2菌株可以形成褶皱的菌落形态,而ΔywbB突变子菌落形态平坦,没有褶皱。在2×SG培养基中培养60 h后,NCD-2菌株的芽胞形成率达到68.6%,而ΔywbB突变子的芽胞形成率仅为18.5%。通过RT-qPCR技术分析了ywbB突变后对其上游基因ywbA、下游基因ywbC、芽胞形成相关基因spoIIAA表达量的影响,结果表明,突变ywbB后对ywbA、ywbC基因的表达量没有明显的影响,而ΔywbB突变子中spoIIAA的表达量较NCD-2野生型菌株相比显著降低。     

利用双亲灭活原生质体融合技术选育高效苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌融合菌株

苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。     

短短芽胞杆菌B011基因组中芽胞形成调控基因spo0E的鉴定与表达分析

短短芽胞杆菌B011是一株具有广谱抗菌活性的植物内生菌,发酵后期形成芽胞。据报道,芽胞形成调控基因Spo0E的编码产物能对Spo0A～P蛋白因子去磷酸化,从而实现芽胞形成的负调控。为了能够进一步验证B011基因组中Spo0E基因的功能和表达情况,为B011菌株的遗传改造提供候选基因,本研究基于B011全基因组序列,通过生物信息学工具预测得到了9个spo0E类似基因,并与其他已公布全基因组序列的101个短芽胞杆菌Brevibacillus菌株进行比较,结果表明短短芽胞杆菌spo0E家族基因在物种分化前就已经存在。转录组测序结果表明,FO446＿19435和FO446＿04050两个spo0E家族基因在B011中高表达,表达模式表现为先升高,在发酵18 h达到最高,此后下降,这两个基因均存在SQELD基序,推测这两个基因为B011中的两个主效spo0E基因。研究结果可为短短芽胞杆菌B011的进一步开发和利用提供一定的基础。     

苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫的研究进展

植物寄生线虫是一类重要的植物病原生物,给农业生产造成巨大的损失.传统方法防治植物寄生线虫都存在一定的局限性.研究发现苏云金芽胞杆菌对线虫有毒杀活性,为防治植物寄生线虫寻找到了一条新途径.文章介绍了苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫的研究现状,着重阐述了苏云金芽胞杆菌的杀线虫晶体蛋白及其基因、杀线虫机制等方面的研究进展,并探讨了其中存在的问题及其对策.     

GlnA基因对刺糖多孢菌生长发育及多杀菌素合成的影响

谷氨酰胺合成酶（GS,glutamine synthetase）是由GlnA基因编码的生物体中最古老也是最广泛存在的酶,它参与许多生物体中的氮和碳代谢,是生物体氮代谢的关键酶之一,对微生物的生命活动起着重要作用。本文研究了GlnA基因对刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的生长发育及次级代谢产物合成的影响,从刺糖多孢菌基因组中克隆了glnA 基因的部分片段,将其与穿梭载体pOJ260连接,构建敲除载体pOJ260-glnA,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌敲除菌株S.spinosa-△glnA;同时,利用重叠延伸PCR将glnA基因置于红霉素强启动子P_ermE下,并将融合片段P_ermE-glnA与穿梭载体pOJ260进行酶切酶连,构建过量表达载体pOJ260-P_ermE-glnA,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得了刺糖多孢菌过量表达菌株S.spinosa-glnA。表型分析发现,glnA基因的敲除对刺糖多孢菌的菌丝形态、孢子萌发等方面都有显著的抑制作用。HPLC检测分析发现,过量表达菌株中多杀菌素产量相比原始菌株提高到170%;该研究表明glnA基因对刺糖多孢菌的生长发育与多杀菌素的合成有一定的影响,为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。     

Increased activity and reduced sensitivity of glutamine synthetase in glufosinate‐resistant vetiver (Vetiveria zizanioides Nash) cells

Vetiver (Vetiveria zizanioides Nash) cells derived from an inflorescence were cultured in a modified N6 liquid medium supplemented with 10 µm 2,4‐D and 10 mm proline. Exponentially growing cell suspensions were subcultured with a selection medium containing glufosinate (ammonium dl ‐homoalanin‐4‐yl(methyl)phosphinate). The glufosinate‐resistant cells which can grow in a medium containing 5 × 10^?5 M glufosinate was selected by a stepwise selection, and its I₅₀ value was determined to be 4.2 × 10^?5 M. The growth of susceptible cells was inhibited by lower concentrations of glufosinate and its I₅₀ value was 2.5 × 10^?7 M. This indicated that the selected cells were 170‐fold resistant compared with the susceptible cells. Glutamine synthetase (GS) activity of the resistant cells was twice as high as that of the susceptible cells. The I₅₀ values of glufosinate were 3.2 × 10^?5 M and 9.0 × 10^?7 M for GS from the resistant and susceptible cells, respectively. The accumulation of ammonia caused by GS inhibition was higher in the susceptible cells. Absorption of [3,4–¹⁴C]glufosinate was not significantly different between the resistant and susceptible cells. Both cell types did not metabolize glufosinate. These results suggest that the resistance of the selected vetiver cell suspension to glufosinate is mainly due to increased GS activity and its decreased sensitivity to the herbicide.     

苏云金芽胞杆菌XL6 BTXL6_11095基因对生物被膜相关表型的调控

在细菌生物被膜（bacterial biofilm,BBF）状态下,细菌往往具有更强的抗紫外线能力、环境适应性和耐药性。本课题组在前期工作中通过转座子插入突变强生物被膜产生菌苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）XL6,筛选出了一个可能调控生物被膜的基因BTXL6_11095。本文以该基因为研究对象,通过生物信息学手段分析该基因功能,构建了BTXL6_11095基因敲除菌株,并对其生物被膜相关表型进行了分析。生物信息学分析结果表明BTXL6_11095基因的结构域为PAS-GGDEF-GGDEF-EAL。生物被膜相关表型分析表明,与野生菌株相比,基因敲除菌株的生长曲线基本不变,群游能力上升,生物被膜形成能力减弱、UV-B抗性降低。本研究通过对BTXL6_11095基因表型变化综合评估,从功能角度揭示此基因对Bt XL6生物被膜相关表型的影响,为进一步解析Bt XL6生物被膜调控网络和构建高抗UV的工程生物被膜奠定了基础。     

噬菌体在苏云金芽孢杆菌发酵中的感染因素

采用4类噬菌体对9株不同血清型苏云金杆菌菌株进行了敏感试验。结果表明，不同菌株敏感性差异较大，其中CZE99985菌株在35～37℃下对4种噬菌体具有明显的抗性。通过对噬菌体的侵入时间和侵入量的测定，结果表明噬菌体侵入时间越早，侵入量越高，其感染造成的危害越大。培养12h前，接入一定量的TP-1型噬菌体会导致发酵异常；在发酵初期，侵入量达到0．5ml（4PFUs／m1）以上便发生严重的感染现象。     

苏云金芽胞杆菌cry8Ea启动子区orf1片段缺失增强启动子活性

本文分别构建了cry8E基因上游的启动子(Porf18E)和其上游缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)融合lacZ基因的表达载体,通过β-半乳糖苷酶活性的分析,发现PΔorf18E的转录活性高于Porf18E。分别用PΔorf18E和Porf18E指导cry1Ac基因的表达,通过光学显微镜观察,发现两个启动子指导表达的Cry1Ac蛋白均可形成双锥形晶体;通过总蛋白定量分析发现,缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)指导的Cry1Ac蛋白表达量高于Porf18E启动子指导的Cry1Ac蛋白表达量;生物活性测定表明:PΔorf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾Plutella xylostella具有杀虫活性,高于Porf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性。本文获得的强活性的启动子PΔorf18E是目前已报道的转录活性最高的cry基因启动子,该启动子为Cry蛋白的表达和遗传工程菌株构建提供了重要元件。     

Insecticidal activity of glufosinate through glutamine depletion in a caterpillar

The herbicide glufosinate‐ammonium (GLA) is a competitive inhibitor of glutamine synthetase (GS), an enzyme converting glutamate to glutamine in both plants and animals. Because GS is essential for ammonia detoxification in plants, GLA treatment disrupts photorespiration by causing a build‐up of ammonia and a loss of glutamine in plant tissues. This study reports that GLA applied to leaf surfaces is also toxic to 5th‐instar caterpillars of the skipper butterfly Calpodes ethlius (LD₅₀ = 400 mg kg⁻¹). After ingesting GLA, caterpillars stopped feeding and became dehydrated through a loss of rectal function. Caterpillars showed symptoms of neurotoxicity, such as proleg tremors, body convulsions and complete paralysis before death. Incubation of several tissues isolated from normal feeding‐stage caterpillars with the GS substrates glutamate and ammonium showed that GLA inhibited GS activity in vitro. Within 24 h of ingesting GLA, caterpillars had a greatly reduced glutamine content and the ammonium ion levels had more than doubled. Injection of ammonium chloride into non‐GLA‐treated caterpillars had no deleterious effect, suggesting that glutamine depletion, and not a rise in body ammonium, was the primary cause of GLA toxicity following GS inhibition. This was supported by the observation that the onset of the symptoms of GLA poisoning could be postponed by giving GLA‐fed caterpillars several subsequent daily injections of glutamine. The effective GLA dose fed to 5th‐instar caterpillars in this study was comparable to the amount that might realistically be acquired from feeding on GLA‐treated crops. © 2001 Society of Chemical Industry     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC₅₀为13.1 μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

Ion regulation in the larval lepidopteran midgut and the response to Bacillus thuringiensis δ-endotoxin

Fourth-instar Bombyx mori (silkworm) was used as a model insect to study the effects of Bacillus thuringiensis (Bt) on ion homeostasis in the larval lepidopteran midgut. The K⁺ chemical gradient across the midgut of B. mori larvae is quite small, sustained by a lumen/haemolymph activity ratio of only 1.6. More than 95% of the driving force causing K⁺ flux from lumen to haemolymph is electrical. In contrast to K⁺, the H⁺ chemical gradient is exceedingly large, with luminal pH values of 11–12 and haemolymph/lumen H⁺ ratios as high as 10⁵. At equilibrium, the steep proton gradient is consistent with a passive distribution of H⁺ across the midgut epithelium as predicted from the Nernst equation. In B mori larvae, ingestion of a lethal dose of Bt δ-endotoxin produces an increase in K⁺ conductance in the midgut apical epithelium, causing a decrease in the electrical gradient and dissipation of the pH gradient. Larval morbidity can be correlated with a rise in haemolymph K⁺ and pH and a decline in luminal pH. Midgut K⁺ activity, however, remains unchanged. An important factor in the pathogenesis of Bt is irreversible alkalization of the epithelial cells as H⁺ is redistributed across the midgut to reach a new Nernst equilibrium.