J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.     

禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。     

Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根据Hexon基因序列设计特异引物,上游引物5'端加TAG序列,下游引物5'端加生物素,进行PCR扩增,将扩增产物与链霉素亲和蛋白、磁珠37℃孵育30 min,通过Luminex200仪器分析。用所建立的液相基因芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及病料样品的检测。结果该方法的特异性强;检测的敏感性可达1×102copies/μL;批内批间的变异系数都在5%以下;检测结果与SYBR Green I荧光PCR方法 100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特异性好、灵敏高、重复性好,可用于I群禽腺病毒的检测。     

Ⅰ群禽腺病毒通用型二温式PCR和VPCR方法的建立及初步应用

为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ 12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法.结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃～94℃变性3 s、70℃～74℃退火兼延伸8 s,循环35～40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5...     

I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立I群禽腺病毒4型血清学检测方法,本研究利用纯化的I群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法。结果显示,抗原最佳包被浓度为1 μg/mL;最佳封闭液为1%牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60min;最佳显色时间为10min。用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测。     

应用PCR检测禽腺病毒

根据禽腺病毒 CELO株的基因序列 ,设计合成了 1对引物 :上游引物为 5′-CCCTCCCACCGC-TAACCA-3′,下游引物为 5′-CACGTTGCCCTTATCTTGC-3′。用这对引物对 群禽腺病毒中 1 2个血清型病毒和 1 9个分离野毒株、 群 4个血清型病毒、 群禽腺病毒株的核酸模板进行了 PCR扩增 ,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的 4 2 1 bp片段 ,而对其他 5种禽病病原体和哺乳动物腺病毒血清 2型核酸模板的扩增均为阴性。该 PCR能检出 1 fg禽腺病毒 DNA模板     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

禽黄病毒病是新发的一种疫病,可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法。结果:该套式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点,最低病毒检测量为101.89TCID50/0.1 mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测,总阳性率为58.14%,而用普通RT-PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。结果表明,禽黄病毒套式RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点,可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

Ⅰ群禽腺病毒的分离检测方法与疫苗研究进展

群禽腺病毒感染主要引起禽包涵体肝炎、心包积液综合征等,具有传播速度快、传播范围广的特点,给我国禽养殖业带来了严重的经济损失。Ⅰ群禽腺病毒分为12种血清型,各血清型之间不仅能交叉感染,还能与其他禽类致病微生物发生混合感染而且各个血清型之间交叉保护很弱甚至没有,给Ⅰ群禽腺病毒病诊断和疫苗研发带来很多困难。文章对Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、实验室检测以及疫苗研发最新进展进行综述,为Ⅰ群禽腺病毒检测方法和疫苗研发提出提供合理的建议。     

禽腺病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

禽腺病毒4型(FAdV-4)是心包积水综合征的重要病原。本研究拟建立FAdV4荧光定量PCR检测方法,为FAdV4感染的流行病学调查、早期诊断、疫病净化提供技术手段。根据GenBank中的禽腺病毒4型六邻体(hexon)基因序列,设计一对引物,扩增hexon基因,将目的基因与载体pEASY-T3连接,构建重组阳性质粒pEAST-T3-H,利用所制备的质粒pEAST-T3-H为模板,对PCR反应体系、反应条件进行优化。建立了禽腺病毒4型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,检出的标准品的敏感性为1.7×10拷贝/μL,优于常规的PCR检测方法。该方法与其他禽病病毒均无交叉反应。表明该方法具有特异型强、灵敏度高、重复性好的特点,可用于临床样本的检测。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV—Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-I快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-Ⅰ A66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100Pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10^6倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。     

Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株Hexon蛋白全基因序列测定和酶切位点分析

利用3对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增,并进行序列测定和PCR-RFLP分析,通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。结果显示,Hexon基因全长为2 800左右个核苷酸,编码约940个氨基酸,不同血清型之间的同源性为75.2%～99.5%,变异范围是0.0%～24.3%。推导的氨基酸同源性为20.7%～98.8%,差异性为0.0%～24.2%。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价Ⅰ群禽腺病毒家族的种系发育关系,构建的进化树显示出5个主要的分支。选用限制性内切酶HaeⅡ,利用存在差异的Hexon序列片段D特异性可以有效区分大部分血清型。结果表明,获得了Ⅰ群禽腺病毒12个血清型不同毒株的Hexon全基因序列并进行了分子进化分析,同时结合12个血清型PCR-RFLP分析,为进一步分析鉴别Ⅰ群禽腺病毒不同血清型提供依据。     

用PCR检测与HHS有关的禽腺病毒

心包积水肝炎综合征(HHS)是一种正在出现的疾病,可以引起严重的心包积水。肉鸡业以前对这种疾病还不清楚。为了检测与HHS有关的禽腺病毒(FAV),荷兰研究人员研制了一种PCR法。从不同的现地暴发收集了37份肝组织样品。从感染肝纯化这种病毒,用电镜和试验感染证实。研制了许多方法     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。     

禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法

禽腺病毒Ⅰ群(FAV-Ⅰ)是一种双链DNA病毒,病毒对外界环境耐受较强,并有水平传播及垂直传播两种传播方式,近年来在国内呈暴发式流行,各地养殖场均有报道检测到FAV-Ⅰ,FAV-Ⅰ对养殖业造成严重损失。分离、鉴定FAV-Ⅰ的毒株类型是防控此病的基础。除传统的检测方法外,近年新兴了多种检测技术,对这些分离、鉴定方法进行了概述。     

禽腺病毒Ⅰ群C种4型病毒的荧光PCR诊断方法的建立

心包积水-肝炎综合征(HHS),是由腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ群C种4血清型病毒引起的一种鸡新型传染病,对养鸡业危害较大。当前该病的诊断主要依靠普通PCR,敏感性和高通量受到限制。本研究建立了一种Taqman荧光PCR方法,该方法特异性强,敏感性高较普通PCR提高1 000倍,经临床样品验证,本方法适用于临床发病病例的诊断和临床正常鸡只的流行病学调查,并适用于高通量检测。为该病的防控提供了一种有效的手段。