铁皮石斛梢枯病病原菌分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌代谢产物对其防治效果

梢枯病是浙江省武义县寿仙谷铁皮石斛种植基地一种常见的真菌病害,严重影响铁皮石斛的产量与品质,而鉴定枯梢病的病原菌是有效防治该病害的前提条件。本文通过对铁皮石斛染病组织培养、病原菌分离纯化,柯赫法则验证、形态学观察与基因序列比对分析(Alta1、EF-1α、RPB2、ATP、His 3)等,明确了引起浙产铁皮石斛梢枯病的病原菌为链格孢菌Alternaria alternata。淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628代谢产物对链格孢菌菌丝生长有较强的抑制作用,IC₅₀为0.461%(体积浓度)。田间试验结果表明,在7和14 d的校正防效分别为68.35%和65.97%,均显著高于阳性对照50%多菌灵。本研究明确了铁皮石斛梢枯病病原菌的分类地位,并获得能够有效抑制该病原菌的微生物抑菌物质淀粉酶产色链霉菌代谢产物,为后续浙产铁皮石斛梢枯病的防治提供了实践依据。     

浙麦冬黑斑病病原菌的分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌对其生物防治效果

黑斑病是浙江省慈溪市浙麦冬种植基地常发病害,传染速度快且严重影响麦冬的产量与品质。为了明确引起黑斑病的病原菌以便后续有效防治该病害,本文通过对染病组织培养、病原菌分离纯化和柯赫法则验证、形态学观察与基因序列分析比对（ITS、EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP）,最终鉴定出引起浙麦冬黑斑病的病原菌是链格孢菌Alternaria alternata。研究淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes 1628代谢产物对黑斑病的防效结果表明,1628代谢产物对链格孢菌菌丝生长具有较强的抑制作用,其EC₅₀=0.764%（体积浓度）。田间防效结果表明7和14 d校正防效分别可达74.08%和65.28%,均高于阳性对照多菌灵。本研究明确了浙麦冬黑斑病病原菌的分类地位,并筛选到能有效抑制该病原菌的生防菌株淀粉酶产色链霉菌,为后续浙麦冬黑斑病的防治提供依据。     

AdpAsd对于淀粉酶产色链霉菌1628的形态分化和丰加霉素合成的影响

为阐明AdpA与淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628形态分化和合成丰加霉素（Toyocamycin,TM）的相关性。本研究设计简并引物成功克隆了来源于淀粉酶产色链霉菌1628大小为1263 bp的adpA_sd基因（GenBank登录号：JX847412）。结果发现,AdpA_sd的氨基酸序列与灰色链霉菌Streptomyces griseus的AdpA_g及天然色链霉菌Streptomyces coelicolor的AdpA_c的同源性分别为80.7%和78.9%。将adpA_sd基因置于载体pIB139启动子PermE^*下游,构建了重组质粒pIB139-adpA_sd,将其通过接合转移法分别转入菌株1628-T15（高产TM）和1628-T62（低产TM,孢子合成受阻）中,获得重组菌1628-T15A和1628-T62A。结果表明,与出发菌株1628-T62相比,重组菌1628-T62A产孢能力得到一定程度的恢复;重组菌1628-T15A与出发菌株1628-T15相比,整体形态无明显变化。摇瓶发酵试验表明,重组菌1628-T62A较出发菌株1628-T62的TM合成能力显著提高,最终TM产量提高了近3倍,而重组菌1628-T15A的TM产量比出发菌株1628-T15仅有小幅提升。以上结果证实adpA_sd参与淀粉酶产色链霉菌1628形态分化以及TM合成,为今后深入理解adpA_sd的分子调节机制奠定了基础。     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

铁皮石斛镰刀菌根腐病病原菌的鉴定及其对链霉菌发酵液的敏感性分析

根腐病是危害浙江省铁皮石斛的重要病害之一,鉴定根腐病的病原菌是有效防治该病害的前提条件.为进一步明确前期经柯赫法则验证为病原菌的镰刀菌(编号为GF-14)分类地位,本研究通过形态学鉴定,并结合内源转录间隔区(rDNA-ITS)、翻译延伸因子(TEF-1α)和RNA聚合酶基因(RPB1和RPB2)等序列的同源性比对及系统...     

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。     

甘蓝枯萎病病原菌的鉴定

 采用温室接种致病性测定、形态学观察和分子鉴定方法对甘蓝枯萎病病原进行了研究。从北京市延庆县9个甘蓝生产基地采集甘蓝枯萎病病样96份,分离获得来自甘蓝病株根、短缩茎、叶片等器官的30个真菌分离物。经过致病性试验证实,分离物GLW3和GLW8为甘蓝枯萎病病原菌。经形态学鉴定,GLW3为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),GLW8为轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)。利用镰刀菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的保守性和变异性,分别采用真菌通用引物和镰刀菌属及轮枝样镰刀菌特异性引物对GLW3和GLW8进行PCR扩增,并将测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,分子鉴定与形态学鉴定结果一致。轮枝样镰刀菌作为甘蓝枯萎病的病原菌系首次报道。     

中国番木瓜枯萎病病原菌的首次鉴定

从发病的番木瓜茎基部组织分离培养得到纯分离物,采用形态学和分子生物学方法进行分离物鉴定。经过致病性测定证实,分离物确定为番木瓜枯萎病的病原菌;通过形态学观察表明,与茄腐镰刀菌(Fusarium solani)形态一致。根据真菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)的保守性和变异性,采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,然后将PCR产物纯化后直接测序,对测试菌株与10株来自GenBank中的菌株ITS序列进行聚类分析,结果表明,测试菌株与GenBank上注册的茄腐镰刀菌GU134886、GQ451337、EU625405、EF534183和GQ376115聚在同一分枝上,分子鉴定结果与形态学观察结果一致,此为国内首次报道。     

杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究

本研究从河南黄河湿地采集土壤样品,采用梯度稀释涂布平板法分离和平板对峙培养法筛选获得一株对苦瓜枯萎病菌具有稳定拮抗活性的链霉菌WLU210。在形态学鉴定和生理生化特征测定的基础上,对菌株WLU210的16S rRNA基因序列进行比对分析,将WLU210鉴定为杨浦链霉菌Streptomyces yangpuensis;拮抗谱测定结果表明,杨浦链霉菌WLU210对苦瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌、小麦茎基腐病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌和玉米大斑病菌等7种植物病原菌均具有一定的拮抗活性;盆栽试验和田间试验结果表明,杨浦链霉菌WLU210发酵液具有有效防治苦瓜枯萎病和促进苦瓜生长的作用,田间防治效果达68.89%。由此可见,杨浦链霉菌WLU210具有作为防治苦瓜枯萎病生防菌剂研发的潜力。     

西瓜枯萎病生防链霉菌的筛选及其防治机理研究

为了安全高效地防治西瓜枯萎病,本研究用平板对峙法从本实验室保存的7株链霉菌中筛选出拮抗西瓜枯萎病效果良好的链霉菌,并结合链霉菌发酵滤液和菌体粗提物对西瓜枯萎病菌生长的抑制效果进行复筛。结果表明：7株链霉菌中,YC2-17(Streptomyces tunisialbus)和YC5-15(S. eurocidicus)对西瓜枯萎病菌抑制效果最好,抑菌率可达56.21%和54.72%。西瓜幼苗的促生试验结果表明,这两株链霉菌对西瓜幼苗的生长都具有显著的促进作用,其中链霉菌YC2-17的促生效果更强,YC2-17处理后西瓜幼苗的株高、根长、鲜重和干重分别增加了52.54%、27.65%、109.57%和100.00%。盆栽防病试验结果表明,YC2-17和YC5-15发酵液对西瓜枯萎病的防效可达56.82%和50.45%。YC2-17发酵滤液的乙酸乙酯相粗提物处理可以抑制西瓜枯萎病菌的孢子萌发,减少其产孢量,改变孢子和菌丝体的形态,处理后菌丝和孢子外部形态异常、躯干干扁,内容物外渗。     

链霉菌组合ST-2发酵条件优化及对黄瓜枯萎病的防治效果

为实现黄瓜枯萎病的生物防治,本研究对海洋拮抗放线菌组合Streptomyces spp.ST-2(包含菌株GQ-17、YH-91、YH-23)的发酵培养基配方及发酵条件进行了探讨,期望提高其生防效果和植株生长量。采用皿内共培养法、牛津杯法分别测定了3株生防链霉菌的共生性及单菌株抗菌活性;通过单因素试验和正交试验确定了ST-2组合最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件;通过盆栽试验研究了ST-2组合菌剂对黄瓜植株的促生防病效果。菌株GQ-17、YH-91和YH-23的无菌发酵液对黄瓜枯萎病菌Fusarisum oxysporum f.sp.cucumebrium抑菌圈直径分别为24.2、20.4和14.4 mm,且3株菌间无生长抑制,可共生;组合菌剂ST-2的最佳发酵培养基配方为:玉米粉8 g/L、黄豆粉10 g/L、氯化钠2.5 g/L、碳酸钙2.0 g/L,p H自然;当菌株GQ-17、YH-91和YH-23种子液以3:3:2配比,以3%接种量接入50 m L液体培养基中,31℃、150 r/min振荡培养5 d,其发酵液对黄瓜枯萎病具有最好的防治效果,相对防效达65.89%,且显著高于单菌株(19.94%,25.20%,42.88%)及申嗪霉素(39.50%)的效果。此外,ST-2组合菌剂施用后,处理植株株高(42.30 cm)和茎粗(6.84 mm)较对照(株高32.60 cm,茎粗6.07 mm)分别增加29.75%和12.69%,显著提升了植株生物量。     

植物内生特基拉芽胞杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病效果

为了筛选新的生防菌菌种资源,采用稀释涂布平板法从番茄植株中分离得到一株内生细菌wm031,采用平板对峙法研究其对病原菌的抑制效果,结合菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标,对其进行初步鉴定,明确分类地位,并采用温室栽培试验对其进行抗病效果初探。结果表明,该菌株对西瓜枯萎病菌具有显著拮抗作用,同时对油菜菌核病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒疫霉病菌、大蒜菌核病菌、水稻恶苗病菌、葡萄炭疽病菌和番茄枯萎病菌均具有广谱抗性。根据菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标的结果,初步鉴定该菌为特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilens。该菌株能够在西瓜和水稻植株中稳定定殖。温室栽培试验表明,菌株wm031对西瓜枯萎病具有显著的防治效果74.6%,高出百菌清的防治效果14.1%,说明该菌株具有田间应用开发的潜力。     

草莓枯萎病拮抗细菌的筛选及其防治效果

为防控草莓枯萎病,本研究通过测定生物量、初筛、复筛和相容性试验,筛选出生长速度较快且抑菌效果良好的菌株SA-1和SV-2,经形态观察、Biolog和分子生物学方法分别鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens。盆栽试验评价了菌株SA-1和SV-2发酵液单一使用及联合使用对草莓枯萎病的防治效果及对草莓植株促生和相关酶活的影响,结果表明菌株SA-1和SV-2发酵液联合使用比单一使用具有更好的生防效果,灌根40d后防治效果为71.33%,过氧化氢酶活性显著增强,丙二醛含量明显减少,在草莓枯萎病生物防治中有一定应用潜力。     

香蕉枯萎病生防菌肥的优化及其防病促生效果研究

为了进一步改良拮抗菌在生物菌肥中的生存条件,提高香蕉枯萎病生防菌肥的防病促生效果,以GFP标记的拮抗木霉GFP-gz-2为指示菌,对生物肥中与拮抗菌菌株生长相关的多种因子进行了优化,并进一步评价了菌肥优化前后的防病促生效果。试验结果表明,在菌肥的7种待添加碳源中,糯米粉为菌株GFP-gz-2的最佳碳源,当糯米粉的含量为35 g/L时,其菌落直径和产孢量达到最大值;在菌肥成分的6种金属离子中,Ca²⁺最利于菌株GFP-gz-2的生长。多因素正交优化结果表明,适于菌株GFP-gz-2生长的生物肥最佳配制条件为有机肥的C/N为30：1,Ca²⁺浓度为5%,菌株的接种量为2.0×10⁶孢子/g。在该条件下,菌株GFP-gz-2在生物肥中的定殖数量为1.033×10⁸孢子/g。改良菌肥对香蕉枯萎病的防治效果达到84.75%,比优化前防效提高15.26%。改良菌肥可显著提高香蕉的株高、茎围、鲜重及干重,比优化前分别提高23.35%、22.82%、68.78%和50.17%,具有明显的促生作用。     

棉花枯萎病拮抗短小芽胞杆菌筛选鉴定及生防研究

为获得对棉花枯萎病有较好生防效果的拮抗细菌,从健康海岛棉植株根围土壤中分离筛选棉花枯萎病拮抗细菌,探索研究拮抗菌株的抑菌作用,为其生物防治提供潜在资源菌。采用平板对峙法,以海岛棉枯萎病尖孢镰刀菌为靶标菌,从土壤中分离到的120株细菌菌株中筛选拮抗菌株。测定拮抗细菌发酵液抑菌活性,通过促芽和盆栽试验筛选生防效果最好的菌株,同时测定该菌株对棉花枯萎病的抑菌效果和耐盐碱性。基于形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定菌株分类地位。从120株细菌中筛选到1株对棉花枯萎病拮抗作用很强的菌株,编号为KX-33。促芽分析和盆栽试验结果表明,菌株KX-33能明显缩短出芽时间,促进棉苗生长。对病原菌DD64、DD89、DD11和DD22防效分别为75.32%、72.77%、69.48%和68.81%,均显著高于对照药剂处理（P<0.05）。耐盐碱分析表明,菌株KX-33具一定的耐盐碱性。菌株KX-33镜检为革兰氏阳性菌、呈杆状、有芽胞,16S rDNA和序列与Bacillus pumilus（FJ763643.1）同源性最高。海岛棉根围土壤微生物中含有棉花枯萎病拮抗细菌,经鉴定菌株KX-33为短小芽胞杆菌Bacillus pumilus,促生和抑菌作用显著,在海岛棉枯萎病生物防治中具有潜在的应用价值。     

木霉菌对黄瓜幼苗生长和膜脂过氧化指标的影响及对枯萎病的防治效果

本文开展了3种生防木霉菌,包括棘孢木霉Trichoderma asperellum 525、哈茨木霉T.harzianum 610和拟康氏木霉T.pseudokoningii 886防治黄瓜枯萎病的盆栽试验,研究这3种木霉菌对黄瓜幼苗生长、膜脂过氧化指标的影响及对黄瓜枯萎病的防治效果。结果表明,木霉菌对黄瓜枯萎病的田间防治效果均达到78%以上,且以棘孢木霉525的田间防治效果最高,达到81.53%。与只接种枯萎病病原菌的对照相比,3株木霉菌单独接种或与黄瓜枯萎病病原菌同时接种均可以显著提高黄瓜幼苗株高、茎粗、叶面积、根体积、地上部鲜重、地下部鲜重,显著提高黄瓜叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）活性,显著降低质膜透性和丙二醛（MDA）含量,其中以拟康氏木霉886单独接种促进效果最强。研究表明,3种木霉菌通过促进黄瓜幼苗生长,增强植物抗氧化酶活性,降低质膜透性和丙二醛含量,从而提高对黄瓜枯萎病的抗性。     

香蕉枯萎病拮抗菌贝莱斯芽胞杆菌的筛选鉴定及其生物学特性

香蕉枯萎病是目前香蕉产业面临的毁灭性病害,目前尚无特别有效的防治药剂.为发掘香蕉枯萎病的生防菌资源,本研究通过初筛和复筛获得两株对香蕉枯萎病菌具有较强拮抗活性的菌株Blz67和Blz02.依据形态学观察及生理生化测试结果,并结合16S rRNA和gyrA基因序列分析,将两株拮抗菌鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus v...